本文關(guān)鍵詞： 腎細(xì)胞癌 TIM-3 多態(tài)性 腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞 調(diào)節(jié)性B細(xì)胞　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的近年腎細(xì)胞癌發(fā)病率在男性惡性腫瘤中位居第7,作為泌尿系統(tǒng)常見腫瘤之一發(fā)病率以每年2-4%的幅度遞增。外科手術(shù)對于大多數(shù)腎細(xì)胞癌患者而言是最主要的治療方式,它在早期腎癌患者中已取得很好的療效,但對多數(shù)腎癌患者而言,切除腎臟原發(fā)灶后,影響患者生存率和死亡率的主要因素仍然是腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。而且腎癌對放化療敏感性較差,5年生存率在發(fā)生轉(zhuǎn)移后降至5-10%。因此,進(jìn)一步探索新的抗腎癌手段,增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤的能力,具有極為重要的意義。T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白分子3(TIM-3)作為免疫球蛋白超族成員,在完全分化的Th1淋巴細(xì)胞上高表達(dá),同時也是Th1 CD4+細(xì)胞的特異性細(xì)胞標(biāo)志物。已有研究表明TIM-3可以抑制IL-2和γ-IFN的產(chǎn)生,從而加速腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散;同時在部分腫瘤(胃癌、大腸癌等)患者及動物的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞上大量表達(dá)的TIM-3還能發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用,誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的功能減弱及凋亡,進(jìn)而削弱機(jī)體抗腫瘤免疫能力。但是TIM-3在腎癌患者中起到何種作用,其對腫瘤患者的哪些免疫細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用,其具體機(jī)制如何,目前尚未見報道。一個生物群體中同時和經(jīng)常存在兩種或兩種以上的不連續(xù)的變異型或基因型或等位基因被稱為多態(tài)性,單核苷酸多態(tài)性是最常見的多態(tài)性類型之一。基因多態(tài)性在臨床工作中的重要意義在于被用于分析人體對疾病、毒物等的易感性和耐受性、疾病臨床表現(xiàn)多樣性及對藥物治療反應(yīng)性等。目前關(guān)于TIM-3的多態(tài)性表現(xiàn)已有文獻(xiàn)報道,但是關(guān)于其與腎癌易感性之間的相關(guān)性如何未見報道。本課題基于上述原因擬研究TIM-3多態(tài)性與腎癌易感性之間的關(guān)系,同時探討不同腎癌分期患者體內(nèi)TIM-3的分布情況、TIM-3與不同分期腎癌患者Th1、CD4+、CD8+Treg、Breg等免疫細(xì)胞功能的關(guān)系,探討TIM-3參與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的作用及機(jī)制,進(jìn)一步明確不同分期的腎癌患者體內(nèi)TIM-3所起的作用是否不同,為探索新的治療腎癌的方法充實(shí)理論基礎(chǔ)。研究方法第一部分:本實(shí)驗(yàn)首先收集322名腎癌患者和402名健康人的血液,主要運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制片段長度多態(tài)性分析技術(shù),對TIM-3基因多態(tài)性中最常見的三種類型(即-1516G/T,-574G/T和+4259T/G)進(jìn)行基因分型,據(jù)此評估在中國人群中,TIM-3多態(tài)性是否和腎癌的易感性存在有關(guān)性。第二部分:在實(shí)驗(yàn)的第二部分,我們收集了30名腎癌患者的腫瘤組織標(biāo)本及外周血,同時采集來自10名健康體檢人群的外周血標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)對照,使用流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時定量PCR等技術(shù),研究TIM-3在TIL CD4+T細(xì)胞和TIL CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)及功能情況,用于明確TIM-3在腎癌中對腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞發(fā)揮的作用。第三部分:我們收集了8名I、II期腎癌患者與7名III、IV期腎癌患者的腫瘤組織標(biāo)本及外周血,統(tǒng)計腫瘤大小及有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等情況,通過細(xì)胞分離、ELISAs及T細(xì)胞增殖和促炎性細(xì)胞因子檢測等方法,分別研究外周血及腫瘤組織的各類細(xì)胞中,IL-10+細(xì)胞的分布情況、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中IL-10分泌型B細(xì)胞的表型、腫瘤浸潤型B細(xì)胞中抗體的分泌情況、腫瘤組織中IL-10分泌型B細(xì)胞的免疫抑制功能及其與TIM-3和腎癌臨床進(jìn)展的相關(guān)性。結(jié)果1.第一部分(1)-574G/T和+4259T/G單核苷酸多態(tài)性在腎癌患者中的發(fā)生率明顯高于對照組,而-1516G/T SNP單核苷酸多態(tài)性的發(fā)生率沒有統(tǒng)計學(xué)差異。同時,-574G/T和+4259T/G等位基因在腎癌患者中也明顯增加。(2)TIM-3-574G/T和+4259T/G SNPs互相之間具有較強(qiáng)的LD,而-1516G/T和-574G/T,或者-1516G/T和+4259T/G之間沒有LD,腎癌患者中TTG的單體型的發(fā)生率明顯高于對照組。(3)與未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者相比,轉(zhuǎn)移患者中+4259T/G等位基因的發(fā)生率明顯增加,然而這些多態(tài)性在糖尿病和腫瘤組織學(xué)類型中并沒有顯示出任何差別。2.第二部分(1)TIM-3在腎癌患者的TIL CD4+和TIL CD8+細(xì)胞上的表達(dá)顯著升高了,而且與腫瘤分期具有一定的相關(guān)性;(2)在TIL TIM-3(+)細(xì)胞上,GATA-3和IFN-γ表達(dá)下調(diào)了,而T-bet的表達(dá)上調(diào)了。此外,研究結(jié)果顯示TIM-3陽性CD8+T細(xì)胞的STAT5的磷酸化水平較TIM-3陰性對照組降低了60.5%,同樣的,與TIM-3(-)相比,p38在TIL TIM-3(+)CD8+T細(xì)胞中的磷酸化水平下降了30.6%,這些結(jié)果提示在腎細(xì)胞癌中TIM-3陽性腫瘤浸潤性T細(xì)胞的Stat5和p38信號通路受損;(3)使用s TIM-3處理過TIL CD4+T和CD8+T細(xì)胞后,其中的CFSE細(xì)胞的百分比顯著提高,這一結(jié)果表明阻斷TIM-3通路可以強(qiáng)化TIL增殖。此外,TIL CD4+T和CD8+T細(xì)胞中IFN-γ水平在加入s TIM-3后顯著上調(diào),提示這些細(xì)胞的免疫功能因TIM-3的表達(dá)被阻斷而提升。3.第三部分(1)我們分別對循環(huán)型和腫瘤浸潤型淋巴細(xì)胞中的T細(xì)胞(CD3+)和B細(xì)胞(CD19+)分型進(jìn)行檢測,流式分析結(jié)果顯示均有IL-10分泌型細(xì)胞的存在。IL-10+的細(xì)胞相對分布在T細(xì)胞、B細(xì)胞和其它(非T或非B)這三種細(xì)胞分型中因病人不同而有所區(qū)別,但是與循環(huán)淋巴細(xì)胞相比,IL-10陽性細(xì)胞在腫瘤浸潤型細(xì)胞的B細(xì)胞中的相對分布值更高。我們還比較了腫瘤浸潤型淋巴細(xì)胞與外周血淋巴細(xì)胞中的IL-10+細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)IL-10陽性細(xì)胞在腫瘤浸潤型淋巴細(xì)胞中所占比例顯著上調(diào)。在總淋巴細(xì)胞或T細(xì)胞、B細(xì)胞中,未發(fā)現(xiàn)外周血IL-10陽性細(xì)胞頻率和腫瘤浸潤型IL-10陽性細(xì)胞頻率之間存在相關(guān)性;(2)我們對外周血對照組和腫瘤浸潤型淋巴細(xì)胞進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)IL-10在腫瘤浸潤型淋巴細(xì)胞中的分泌水平顯著提高,且腫瘤組織中的IL-10分泌型B細(xì)胞的相對貢獻(xiàn)率,即IL-10分泌型B細(xì)胞與IL-10分泌型T細(xì)胞的相對比值顯著提升;(3)對非IL-10分泌型B細(xì)胞和IL-10分泌型B細(xì)胞進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)IL-10分泌型B細(xì)胞表達(dá)CD19和CD20明顯呈現(xiàn)低水平,同時也缺乏Ig M和Ig D的表達(dá),而CD27的水平卻呈現(xiàn)提高。在未受刺激的情況下,與自體同源的外周血B細(xì)胞相比,腫瘤浸潤型B細(xì)胞上清液中Ig G和Ig A的濃度更高。尤其是,與外周血相比,在腫瘤組織中Ig A的相對濃度(Ig A在總適應(yīng)性免疫抗體Ig G+Ig A中的占比)顯著升高;(4)對腫瘤浸潤型B細(xì)胞進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)IL-10陽性細(xì)胞的頻率與分泌IFN-γ和TNF-α的腫瘤浸潤型T細(xì)胞的頻率之間存在負(fù)相關(guān)性,同時TIM-3在IL-10陽性腫瘤浸潤型B細(xì)胞高表達(dá)的病人中的表達(dá)也上調(diào)了。分別使用腫瘤浸潤型B細(xì)胞上清液和外周血B細(xì)胞上清液培養(yǎng)T細(xì)胞,并檢測兩組間IFN-γ分泌水平和T細(xì)胞增生水平,結(jié)果顯示腫瘤浸潤型B細(xì)胞上清液培養(yǎng)T細(xì)胞IFN-γ分泌水平和T細(xì)胞增生水平顯著降低;(5)IL-10分泌型B細(xì)胞頻率和切除的腫瘤組織大小之間存在正相關(guān)性,而且III期+IV期腫瘤與I期+II期腫瘤相比,IL-10分泌型B細(xì)胞頻率出現(xiàn)明顯提高。此外,III期+IV期腫瘤與I期+II期腫瘤之間分泌IL-10的腫瘤浸潤型B細(xì)胞的頻率的差別不是由性別造成的。結(jié)論本研究首次證明了TIM-3 SNPs和單體型增加了中國人腎細(xì)胞癌發(fā)生的風(fēng)險,同時+4259T/G SNP與腎細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在腎癌腫瘤組織中,TIM-3的表達(dá)水平對T細(xì)胞的功能紊亂有指向作用,且對于免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌以及殺滅腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用。IL-10分泌B細(xì)胞作為成漿細(xì)胞中的嶄新細(xì)胞亞型,對T細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制作用,而TIM-3則可能是B細(xì)胞的一個主要作用途徑,即B細(xì)胞通過上調(diào)T細(xì)胞中TIM-3表達(dá)這一過程,抑制了T細(xì)胞的功能,并進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤免疫逃避的效果。以上結(jié)果為將TIM-3作為腎細(xì)胞癌可能的治療途徑提供了理論依據(jù),預(yù)示著抗TIM-3抗體在將來可能成為一種新型的治療腎細(xì)胞癌的免疫療法,為腎癌的免疫治療提供一種新的潛在選擇。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.11

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本文編號：1556177