本文關鍵詞： 二甲雙胍 膀胱癌 cyclin D1 AMPK mTOR S6K1 TRAIL c-FLIP　出處：《山東大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景： 膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一,近年來其發(fā)病率呈現不斷增高的趨勢。臨床上70%左右的膀胱癌患者確診時為非肌層浸潤性膀胱癌(nonmuscle invasive bladder cancer, NMIBC),其主要治療方法為經尿道膀胱腫瘤電切術(transurethral resection of bladder tumor, TUR-Bt),但術后復發(fā)率高是導致手術治療失敗的主要原因。研究表明,TUR-Bt術后5年腫瘤復發(fā)率高達600%-70%,且有25%左右的患者會進展為浸潤性膀胱癌。目前預防NMIBC患者術后復發(fā)及進展的最有效辦法是在TUR-Bt術后輔以膀胱灌注疫免抑制劑或化療藥物。盡管膀胱灌注在近期具有一定的療效,但目前常用的灌注藥物均存在不同程度的全身或局部毒副反應,包括骨髓抑制、過敏反應以及膀胱刺激征等。此外,仍有20%左右的患者雖經膀胱灌注但腫瘤仍會復發(fā)。患者一旦進展為轉移性膀胱癌,治療主要采用以順鉑為主的化療方案,盡管大多數膀胱癌患者對含順鉑的化療方案比較敏感,但是其療效卻并不能持久,患者5年生存率僅為20%-40%。鑒于目前膀胱癌灌注藥物和化療藥物療效的不穩(wěn)定性及其顯著的毒副作用,尋找安全而有效的膀胱癌治療藥物已經成為腫瘤治療領域研究的熱點和難點。 二甲雙胍是目前臨床應用最為廣泛的口服降糖藥物,主要用于治療2型糖尿病患者。近年來多項體外研究和動物實驗發(fā)現二甲雙胍對多種腫瘤細胞具有一定程度的抑制作用,并可顯著增強化療藥物的抗腫瘤作用。而相關的臨床研究同樣表明,服用二甲雙胍的糖尿病患者罹患惡性腫瘤的風險以及腫瘤相關死亡率明顯小于采用其他降糖藥物或胰島素的糖尿病患者。在患有糖尿病的乳腺癌或肺癌患者中,接受化療的同時服用二甲雙胍可能與更好的預后密切相關,提示二甲雙胍可能具有增強化療方案臨床療效的作用。關于膀胱癌患者的臨床研究同樣表明,在合并患有糖尿病的膀胱癌患者中,服用二甲雙胍降低血糖的患者其腫瘤復發(fā)風險明顯低于未服用二甲雙胍的患者,提示二甲雙胍對膀胱癌患者同樣具有一定程度的保護作用。盡管已有體外細胞實驗、動物實驗以及臨床證據的支持,二甲雙胍抑制腫瘤的作用機制至今仍不清楚,而其對膀胱腫瘤細胞的直接抑制作用,仍需要在體外細胞模型和動物模型中進行驗證。另一方面,卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)作為目前治療中危和高危NMIBC患者首選的灌注藥物,可顯著降低患者疾病復發(fā)和進展的風險,研究表明其抑制膀胱腫瘤的作用可能是以腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體[tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL]作為效應分子實現的,而TRAIL因其本身能夠選擇性地誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡而對大多數正常細胞無毒副作用,已被研究用以治療膀胱腫瘤。結合二甲雙胍可能增強化療藥物臨床療效的實驗數據和臨床證據,我們認為二甲雙胍可能能夠增強TRAIL對膀胱癌細胞的抑制作用,而二甲雙胍聯(lián)合TRAIL極有可能成為膀胱腫瘤的有效治療方案,這同樣需要體外實驗的驗證。本課題的第一部分和第二部分,我們分別在體外細胞模型和裸鼠皮下移植瘤模型中,對二甲雙胍對膀胱癌細胞的抑制作用進行了驗證；本課題的第三部分,我們通過體外細胞實驗對二甲雙胍聯(lián)合TRAIL用以治療膀胱癌的可能性進行了初步探討。 研究內容： 1.以膀胱癌細胞及裸鼠皮下移植瘤模型為研究對象,通過體外實驗和體內實驗檢測二甲雙胍對膀胱癌細胞增殖的抑制作用,并探討二甲雙胍引起上述抑制作用的相關分子機制。 2.以膀胱癌細胞為研究對象,通過體外實驗檢測二甲雙胍是否可以增加膀胱癌細胞對TRAIL的敏感性,并探討二甲雙胍引起上述增敏作用的相關分子機制。 研究方法： 1.采用MTT法檢測不同濃度的二甲雙胍對膀胱癌細胞的增殖活性以及生長曲線的影響；采用平板克隆形成實驗檢測不同濃度的二甲雙胍對膀胱癌細胞體外克隆形成能力的影響； 2.采用Annexin V-FITC/PI染色方法檢測二甲雙胍干預后膀胱癌細胞發(fā)生凋亡的情況；采用Western blot法檢測二甲雙胍是否能夠誘導膀胱癌細胞PARP斷裂活化；采用流式細胞術檢測二甲雙胍對膀胱癌細胞周期的影響；采用Western blot法檢測二甲雙胍對細胞周期G0/G1期關鍵調節(jié)蛋白cyclin D1、CDK4、E2F1和P21的影響； 3.采用Western blot法檢測二甲雙胍對膀胱癌細胞中AMPK (Thr172)、mTOR (Ser2448)、S6K1(Thr389).4E-BP1(Thr37/46)磷酸化水平的影響； 4.構建膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型,檢測腹腔注射二甲雙胍對膀胱癌皮下移植瘤生長的影響,同時觀察二甲雙胍對裸鼠體重、瘤重及飲食量的影響；采用免疫組織化學染色及Western blot法檢測二甲雙胍對膀胱癌皮下移植瘤細胞內PCNA、 cyclin D1、p-mTOR (Ser2448)蛋白表達的影響； 5.采用Annexin V-FITC/PI染色方法檢測二甲雙胍對TRAIL誘導膀胱癌細胞凋亡的影響；采用Western blot法檢測二甲雙胍對TRAIL誘導的caspases激活的影響；采用Western blot法檢測二甲雙胍對TRAIL凋亡通路重要成員DR4、DR5、 c-FLIPL的影響；采用qRT-PCR檢測二甲雙胍干預對c-FLIPL轉錄水平的影響；引入蛋白酶體抑制劑MG132和放線菌酮,分別檢測二甲雙胍干預對c-FLIPL蛋白的降解及其穩(wěn)定性的影響；采用siRNA敲除膀胱癌細胞S6K1驗證二甲雙胍下調c-FLIPL表達的機制。 研究結果： 1.二甲雙胍顯著抑制膀胱癌細胞的體外增殖能力和克隆形成能力 MTT結果顯示二甲雙胍可顯著抑制膀胱癌細胞5637和T24的體外增殖能力,且呈明顯的濃度依賴性和時間依賴性；平板克隆形成實驗顯示二甲雙胍可顯著抑制膀胱癌細胞5637和T24的克隆形成能力,且呈明顯的濃度依賴性。 2.二甲雙胍不能誘導膀胱癌細胞發(fā)生凋亡而誘導其細胞周期阻滯在G0/G1期 Annexin V-FITC/PI染色顯示二甲雙胍并未增加膀胱癌細胞Annexin V陽性細胞的比例,Western blot結果顯示二甲雙胍并未激活膀胱癌中PARP的斷裂活化,提示二甲雙胍不能誘導膀胱癌細胞發(fā)生凋亡；流式細胞術檢測發(fā)現二甲雙胍可顯著增加處于G0/G1期的膀胱癌細胞所占的比例,Western blot結果顯示二甲雙胍顯著下調膀胱癌細胞中cyclin D1、CDK4、E2F1的表達,并可上調P21的表達水平,提示二甲雙胍可誘導膀胱癌細胞周期阻滯在G0/G1期。 3.二甲雙胍激活膀胱癌細胞AMPK/mTOR信號通路 Western blot顯示檢測二甲雙胍顯著增加膀胱癌細胞中AMPK在Thr172位點的磷酸化水平,提示二甲雙胍能夠激活膀胱癌細胞AMPK信號通路；二甲雙胍顯著降低膀胱癌細胞中mTOR在Ser2448位點、S6K1在Thr389位點以及4E-BP1在Thr37/46位點的磷酸化水平,說明二甲雙胍能夠顯著抑制膀胱癌細胞mTOR信號通路。 4.二甲雙胍抑制膀胱癌裸鼠皮下移植瘤的生長 將膀胱癌細胞5637接種于裸鼠左側后腿背側皮下,成功構建膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型；腹腔注射二甲雙胍(100mg/kg/day)可顯著抑制膀胱癌皮下移植瘤的生長并減輕瘤重,而對裸鼠的體重、飲食及一般情況并未產生影響；免疫組織化學染色以及Western blot均證實二甲雙胍可下調膀胱癌皮下移植瘤細胞內PCNA, cyclinD1和p-mTOR (Ser2448)的表達。 5.二甲雙胍增強TRAIL對敏感膀胱癌細胞的凋亡誘導作用 Annexin V-FITC/PI染色和Western blot結果表明,二甲雙胍可顯著增強TRAIL在敏感膀胱癌細胞(5637、253J和RT4)所誘導的Annexin V陽性細胞比例和caspases的活化程度,提示二甲雙胍可增強TRAIL對敏感膀胱癌細胞的凋亡誘導作用；而在TRAIL抵抗性膀胱癌細胞T24中,二甲雙胍并不能逆轉其對TRAIL的抵抗。 6.二甲雙胍通過下調c-FLIPL的表達增加膀胱癌細胞對TRAIL的敏感性 通過對TRAIL/死亡受體介導的凋亡通路中重要成員的檢測,二甲雙胍干預并未上調DR4和DR5的表達水平,而是顯著地下調c-FLIPL的表達以增加膀胱癌細胞對TRAIL的敏感性。 7.二甲雙胍過抑制mTOR/S6K1通路下調膀胱癌細胞c-FLIPL的表達 二甲雙胍干預并未影響c-FLIPL的轉錄、降解和蛋白穩(wěn)定性；Western blot結果表明二甲雙胍干預可顯著下調p-mTOR (Ser2448)和P-S6K1(Thr389)的水平,提示二甲雙胍可抑制膀胱癌細胞mTOR/S6K1通路；采用特異性siRNA敲除膀胱癌細胞S6K1后可顯著下調c-FLIPL的表達水平。 結論： 1.二甲雙胍顯著抑制膀胱癌細胞的體外增殖和裸鼠皮下移植瘤的生長； 2.二甲雙胍通過誘導膀胱癌細胞周期GO/G1期阻滯、激活AMPK/mTOR信號通路,發(fā)揮其對膀胱癌細胞的體外和體內抑制作用； 3.二甲雙胍通過抑制mTOR/S6K1信號通路下調c-FLIPL的表達,增加膀胱癌細胞對TRAIL的敏感性； 4.二甲雙胍單獨或與TRAIL聯(lián)合用藥可能是極具發(fā)展前景且相對安全的膀胱腫瘤治療方案。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.14

【參考文獻】

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1 Valter Donadon;Massimiliano Balbi;Francesca Valent;Angelo Avogaro;;Glycated hemoglobin and antidiabetic strategies as risk factors for hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2010年24期

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本文編號：1553829