發(fā)布時(shí)間：2018-03-01 22:17

  本文關(guān)鍵詞： 二甲雙胍 膀胱癌 cyclin D1 AMPK mTOR S6K1 TRAIL c-FLIP　出處：《山東大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景： 膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一,近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)不斷增高的趨勢(shì)。臨床上70%左右的膀胱癌患者確診時(shí)為非肌層浸潤性膀胱癌(nonmuscle invasive bladder cancer, NMIBC),其主要治療方法為經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)(transurethral resection of bladder tumor, TUR-Bt),但術(shù)后復(fù)發(fā)率高是導(dǎo)致手術(shù)治療失敗的主要原因。研究表明,TUR-Bt術(shù)后5年腫瘤復(fù)發(fā)率高達(dá)600%-70%,且有25%左右的患者會(huì)進(jìn)展為浸潤性膀胱癌。目前預(yù)防NMIBC患者術(shù)后復(fù)發(fā)及進(jìn)展的最有效辦法是在TUR-Bt術(shù)后輔以膀胱灌注疫免抑制劑或化療藥物。盡管膀胱灌注在近期具有一定的療效,但目前常用的灌注藥物均存在不同程度的全身或局部毒副反應(yīng),包括骨髓抑制、過敏反應(yīng)以及膀胱刺激征等。此外,仍有20%左右的患者雖經(jīng)膀胱灌注但腫瘤仍會(huì)復(fù)發(fā)�；颊咭坏┻M(jìn)展為轉(zhuǎn)移性膀胱癌,治療主要采用以順鉑為主的化療方案,盡管大多數(shù)膀胱癌患者對(duì)含順鉑的化療方案比較敏感,但是其療效卻并不能持久,患者5年生存率僅為20%-40%。鑒于目前膀胱癌灌注藥物和化療藥物療效的不穩(wěn)定性及其顯著的毒副作用,尋找安全而有效的膀胱癌治療藥物已經(jīng)成為腫瘤治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。 二甲雙胍是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的口服降糖藥物,主要用于治療2型糖尿病患者。近年來多項(xiàng)體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有一定程度的抑制作用,并可顯著增強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤作用。而相關(guān)的臨床研究同樣表明,服用二甲雙胍的糖尿病患者罹患惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)以及腫瘤相關(guān)死亡率明顯小于采用其他降糖藥物或胰島素的糖尿病患者。在患有糖尿病的乳腺癌或肺癌患者中,接受化療的同時(shí)服用二甲雙胍可能與更好的預(yù)后密切相關(guān),提示二甲雙胍可能具有增強(qiáng)化療方案臨床療效的作用。關(guān)于膀胱癌患者的臨床研究同樣表明,在合并患有糖尿病的膀胱癌患者中,服用二甲雙胍降低血糖的患者其腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)明顯低于未服用二甲雙胍的患者,提示二甲雙胍對(duì)膀胱癌患者同樣具有一定程度的保護(hù)作用。盡管已有體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床證據(jù)的支持,二甲雙胍抑制腫瘤的作用機(jī)制至今仍不清楚,而其對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的直接抑制作用,仍需要在體外細(xì)胞模型和動(dòng)物模型中進(jìn)行驗(yàn)證。另一方面,卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)作為目前治療中危和高危NMIBC患者首選的灌注藥物,可顯著降低患者疾病復(fù)發(fā)和進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn),研究表明其抑制膀胱腫瘤的作用可能是以腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體[tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL]作為效應(yīng)分子實(shí)現(xiàn)的,而TRAIL因其本身能夠選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡而對(duì)大多數(shù)正常細(xì)胞無毒副作用,已被研究用以治療膀胱腫瘤。結(jié)合二甲雙胍可能增強(qiáng)化療藥物臨床療效的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和臨床證據(jù),我們認(rèn)為二甲雙胍可能能夠增強(qiáng)TRAIL對(duì)膀胱癌細(xì)胞的抑制作用,而二甲雙胍聯(lián)合TRAIL極有可能成為膀胱腫瘤的有效治療方案,這同樣需要體外實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。本課題的第一部分和第二部分,我們分別在體外細(xì)胞模型和裸鼠皮下移植瘤模型中,對(duì)二甲雙胍對(duì)膀胱癌細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行了驗(yàn)證；本課題的第三部分,我們通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)二甲雙胍聯(lián)合TRAIL用以治療膀胱癌的可能性進(jìn)行了初步探討。 研究內(nèi)容： 1.以膀胱癌細(xì)胞及裸鼠皮下移植瘤模型為研究對(duì)象,通過體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測二甲雙胍對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的抑制作用,并探討二甲雙胍引起上述抑制作用的相關(guān)分子機(jī)制。 2.以膀胱癌細(xì)胞為研究對(duì)象,通過體外實(shí)驗(yàn)檢測二甲雙胍是否可以增加膀胱癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性,并探討二甲雙胍引起上述增敏作用的相關(guān)分子機(jī)制。 研究方法： 1.采用MTT法檢測不同濃度的二甲雙胍對(duì)膀胱癌細(xì)胞的增殖活性以及生長曲線的影響；采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度的二甲雙胍對(duì)膀胱癌細(xì)胞體外克隆形成能力的影響； 2.采用Annexin V-FITC/PI染色方法檢測二甲雙胍干預(yù)后膀胱癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況；采用Western blot法檢測二甲雙胍是否能夠誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞PARP斷裂活化；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測二甲雙胍對(duì)膀胱癌細(xì)胞周期的影響；采用Western blot法檢測二甲雙胍對(duì)細(xì)胞周期G0/G1期關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白cyclin D1、CDK4、E2F1和P21的影響； 3.采用Western blot法檢測二甲雙胍對(duì)膀胱癌細(xì)胞中AMPK (Thr172)、mTOR (Ser2448)、S6K1(Thr389).4E-BP1(Thr37/46)磷酸化水平的影響； 4.構(gòu)建膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型,檢測腹腔注射二甲雙胍對(duì)膀胱癌皮下移植瘤生長的影響,同時(shí)觀察二甲雙胍對(duì)裸鼠體重、瘤重及飲食量的影響；采用免疫組織化學(xué)染色及Western blot法檢測二甲雙胍對(duì)膀胱癌皮下移植瘤細(xì)胞內(nèi)PCNA、 cyclin D1、p-mTOR (Ser2448)蛋白表達(dá)的影響； 5.采用Annexin V-FITC/PI染色方法檢測二甲雙胍對(duì)TRAIL誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響；采用Western blot法檢測二甲雙胍對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的caspases激活的影響；采用Western blot法檢測二甲雙胍對(duì)TRAIL凋亡通路重要成員DR4、DR5、 c-FLIPL的影響；采用qRT-PCR檢測二甲雙胍干預(yù)對(duì)c-FLIPL轉(zhuǎn)錄水平的影響；引入蛋白酶體抑制劑MG132和放線菌酮,分別檢測二甲雙胍干預(yù)對(duì)c-FLIPL蛋白的降解及其穩(wěn)定性的影響；采用siRNA敲除膀胱癌細(xì)胞S6K1驗(yàn)證二甲雙胍下調(diào)c-FLIPL表達(dá)的機(jī)制。 研究結(jié)果： 1.二甲雙胍顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的體外增殖能力和克隆形成能力 MTT結(jié)果顯示二甲雙胍可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞5637和T24的體外增殖能力,且呈明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示二甲雙胍可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞5637和T24的克隆形成能力,且呈明顯的濃度依賴性。 2.二甲雙胍不能誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生凋亡而誘導(dǎo)其細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期 Annexin V-FITC/PI染色顯示二甲雙胍并未增加膀胱癌細(xì)胞Annexin V陽性細(xì)胞的比例,Western blot結(jié)果顯示二甲雙胍并未激活膀胱癌中PARP的斷裂活化,提示二甲雙胍不能誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生凋亡；流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可顯著增加處于G0/G1期的膀胱癌細(xì)胞所占的比例,Western blot結(jié)果顯示二甲雙胍顯著下調(diào)膀胱癌細(xì)胞中cyclin D1、CDK4、E2F1的表達(dá),并可上調(diào)P21的表達(dá)水平,提示二甲雙胍可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。 3.二甲雙胍激活膀胱癌細(xì)胞AMPK/mTOR信號(hào)通路 Western blot顯示檢測二甲雙胍顯著增加膀胱癌細(xì)胞中AMPK在Thr172位點(diǎn)的磷酸化水平,提示二甲雙胍能夠激活膀胱癌細(xì)胞AMPK信號(hào)通路；二甲雙胍顯著降低膀胱癌細(xì)胞中mTOR在Ser2448位點(diǎn)、S6K1在Thr389位點(diǎn)以及4E-BP1在Thr37/46位點(diǎn)的磷酸化水平,說明二甲雙胍能夠顯著抑制膀胱癌細(xì)胞mTOR信號(hào)通路。 4.二甲雙胍抑制膀胱癌裸鼠皮下移植瘤的生長 將膀胱癌細(xì)胞5637接種于裸鼠左側(cè)后腿背側(cè)皮下,成功構(gòu)建膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型；腹腔注射二甲雙胍(100mg/kg/day)可顯著抑制膀胱癌皮下移植瘤的生長并減輕瘤重,而對(duì)裸鼠的體重、飲食及一般情況并未產(chǎn)生影響；免疫組織化學(xué)染色以及Western blot均證實(shí)二甲雙胍可下調(diào)膀胱癌皮下移植瘤細(xì)胞內(nèi)PCNA, cyclinD1和p-mTOR (Ser2448)的表達(dá)。 5.二甲雙胍增強(qiáng)TRAIL對(duì)敏感膀胱癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用 Annexin V-FITC/PI染色和Western blot結(jié)果表明,二甲雙胍可顯著增強(qiáng)TRAIL在敏感膀胱癌細(xì)胞(5637、253J和RT4)所誘導(dǎo)的Annexin V陽性細(xì)胞比例和caspases的活化程度,提示二甲雙胍可增強(qiáng)TRAIL對(duì)敏感膀胱癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用；而在TRAIL抵抗性膀胱癌細(xì)胞T24中,二甲雙胍并不能逆轉(zhuǎn)其對(duì)TRAIL的抵抗。 6.二甲雙胍通過下調(diào)c-FLIPL的表達(dá)增加膀胱癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性 通過對(duì)TRAIL/死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路中重要成員的檢測,二甲雙胍干預(yù)并未上調(diào)DR4和DR5的表達(dá)水平,而是顯著地下調(diào)c-FLIPL的表達(dá)以增加膀胱癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性。 7.二甲雙胍過抑制mTOR/S6K1通路下調(diào)膀胱癌細(xì)胞c-FLIPL的表達(dá) 二甲雙胍干預(yù)并未影響c-FLIPL的轉(zhuǎn)錄、降解和蛋白穩(wěn)定性；Western blot結(jié)果表明二甲雙胍干預(yù)可顯著下調(diào)p-mTOR (Ser2448)和P-S6K1(Thr389)的水平,提示二甲雙胍可抑制膀胱癌細(xì)胞mTOR/S6K1通路；采用特異性siRNA敲除膀胱癌細(xì)胞S6K1后可顯著下調(diào)c-FLIPL的表達(dá)水平。 結(jié)論： 1.二甲雙胍顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的體外增殖和裸鼠皮下移植瘤的生長； 2.二甲雙胍通過誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞周期GO/G1期阻滯、激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路,發(fā)揮其對(duì)膀胱癌細(xì)胞的體外和體內(nèi)抑制作用； 3.二甲雙胍通過抑制mTOR/S6K1信號(hào)通路下調(diào)c-FLIPL的表達(dá),增加膀胱癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性； 4.二甲雙胍單獨(dú)或與TRAIL聯(lián)合用藥可能是極具發(fā)展前景且相對(duì)安全的膀胱腫瘤治療方案。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.14

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Valter Donadon;Massimiliano Balbi;Francesca Valent;Angelo Avogaro;;Glycated hemoglobin and antidiabetic strategies as risk factors for hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2010年24期

，

本文編號(hào)：1553829