本文關鍵詞： INPP4B PARP抑制劑 人雄激素抵抗性前列腺癌 PC3 p-AKT　出處：《山東大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景 前列腺癌屬于男性泌尿生殖系統(tǒng)比較常見的惡性腫瘤。在歐美男性中,前列腺癌占惡性腫瘤相關死因的第二位,為首發(fā)的癌癥。據(jù)美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計,在2013年有238,590名男性患有前列腺癌,其中29,720會死于前列腺癌或是前列腺癌相關的疾病。前列腺癌在我國的發(fā)病率雖然尚無歐美國家的發(fā)病率高,然則卻也在隨著國人生活水平的提高而逐年升高,目前在男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中,其發(fā)病率已上升為的第3位。內分泌治療是目前全球前列腺癌治療的首選,但是臨床上會觀察到應用內分泌治療一段時間后病人不可避免的會產(chǎn)生激素抵抗,或是有些病人在醫(yī)治初始即對內分泌治療耐藥,研究者將此稱為雄激素抵抗型前列腺癌。此類前列腺癌可以看做是前列腺癌發(fā)展的終末環(huán)節(jié),可供選擇的治療方案相當有限,且病情進展較快,嚴重威脅病人的生命及降低生活質量。因此,此型前列腺癌不僅是前列腺癌治療的難點也是治療重點。如何尋找人雄激素抵抗型前列腺癌有效的治療靶點及相應的診療方法,已經(jīng)成為目前前列腺癌基礎及臨床研究的重要領域。 越來越多的研究認為多聚磷酸肌醇-4-磷酸酶Ⅱ型(INPP4B)是新的抑癌基因,負向調控磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B (PI3K/AKT)信號通路。在人類前列腺癌中,雄激素受體(AR)在轉錄水平正向調節(jié)INPP4B,有研究認為激素抵抗型前列腺癌細胞可能不表達AR,且與正常組織相比,前列腺癌組織INPP4B的表達減少。這些使我們推測如果此類腫瘤細胞中重新表達INPP4B能夠抑制腫瘤的生長。雄激素抵抗型前列腺癌常伴有10號染色體缺失的磷酸酶基因(PTEN)功能異常,最終致使同源重組修復缺陷。在此類腫瘤中應用聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶(PARP)抑制劑能阻斷DNA損傷修復的代償通路,有效殺傷腫瘤細胞。同時有研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中存在PARP過表達,包括雄激素抵抗型前列腺癌,提示PARP抑制劑可能在此類前列腺癌中發(fā)揮治療作用。然而也有報道稱,PARP抑制劑能上調p-AKT水平,激活PI3K/AKT信號通路,從而影響療效并產(chǎn)生耐藥。 綜上,本研究試圖觀察轉染INPP4B基因是否在抑制PC3細胞增殖的同時下調其p-AKT水平,與PARP抑制劑聯(lián)合能否發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。 目的 研究轉染INPP4B基因、PARP抑制劑處理應用對雄激素抵抗型前列腺癌細胞株PC3增殖的影響及兩者聯(lián)合應用能否對此類腫瘤細胞發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。 方法 體外培養(yǎng)PC3細胞及LNcap細胞,取對數(shù)生長期的細胞,逆轉錄PCR檢測PC3細胞中INPP4B mRNA的表達情況(以LNcap為陽性對照)。PC3細胞轉染INPP4B基因后實時定量PCR檢測INPP4B mRNA的相對含量；Western blot檢測PC3細胞由INPP4B蛋白的表達。實驗設CON組、Lenti-INPP4B組、Lenti-GFP組、PARP抑制劑組、Lenti-INPP4B與PARP抑制劑聯(lián)合組、Lenti-GFP與PARP抑制劑聯(lián)合組,CCK-8法、Western blot、流式細胞術分別檢測PC3細胞在各種處理后增殖、細胞中p-AKT表達水平、細胞凋亡及周期分布的改變。 結果 INPP4B mRNA在PC3細胞中呈陰性表達。轉染攜帶INPP4B基因的重組慢病毒后,實時定量PCR顯示Lenti-INPP4B組的INPP4BmRNA相對水平為(87.84±7.62); Western blot檢測顯示在INPP4B蛋白分子量處出現(xiàn)條帶,顯示INPP4B在PC3細胞中成功表達。轉染病毒組：CCK-8法顯示在轉入病毒的第24h、36h、48h, Lenti-INPP4B組細胞活力分別為(66.18%4±2.32)%、(45.10±0.00)%、(29.35±3.19)%,與Lenti-GFP組細胞活力相比,差異有顯著性意義(P0.05)；流式細胞凋亡分析顯示：Lenti-INPP4B組與Lenti-GFP組凋亡比例分別為5.48%、2.85%,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；Western blot顯示Lenti-INPP4B組與Lenti-GFP組相比,p-AKT水平降低。PARP抑制劑組：CCK-8法顯示0.1、1、10、20、40gM五個濃度的AG014699及DMSO作用48h,各組細胞平均活力分別為(93.58±3.51)%、(64.6±2.18)%、(57.15±3.38)%、(43.88±3.02)%、(40.60±0.86)%、(99.76±0.06)%,除0.1μM的AG014699外,剩下各濃度的PARP抑制劑對PC3細胞增殖的抑制作用與DMSO相比差異均有顯著性意義(P0.05)；10μM最接近且小于IC50,將10gM選為單藥及轉染INPP4B基因聯(lián)合的合適濃度；AG014699(10μM)作用24、36、48h,各組PC3細胞平均活力分別為(88.53±1.73)%、(60.77±2.26)%、(54.12±1.96)%,與DMSO相比差異均有顯著性意義(P0.05);PI染色周期分布顯示：1、10、201aM的AG014699作用48h后,G2/M期細胞比例分別為(23.50±2.90)%、(35.10±5.11)%、(55.97±3.75)%,顯示隨著藥物濃度升高,G2/M期比例逐漸增加,高濃度的PARP抑制劑能將細胞阻滯在G2/M期；Annexin V-FITC/PI流式分析顯示,1、10、20μM的AG014699作用于PC3細胞48h,凋亡率分別為6.54%、12.16%、23.53%,顯示隨著藥物濃度增加,凋亡率逐漸增加；同時觀察到細胞內p-AKT水平隨著PARP抑制劑濃度的升高而§增加。轉染INPP4B基因聯(lián)合PARP抑制劑：首先倒置顯微鏡下觀察到聯(lián)合組與單獨處理組相比,細胞數(shù)目明顯減少、細胞皺縮且形態(tài)不規(guī)則；CCK8法檢測顯示細胞活力在24、36、48h分別為(49.85±0.30)%、(26.30±1.81)%、(9.72±3.10)%,與Lenti-INPP4B組、PARP抑制劑組單獨作用相比,對PC3細胞增殖抑制有統(tǒng)計學意義(P0.05)；PI染色周期分布顯示,聯(lián)合組細胞阻滯在G1期；Annexin V-FITC/PI流式檢測顯示PARP抑制劑組、Lenti-INPP4B與PARP抑制劑聯(lián)合組凋亡比例分別為12.16%、17.71%,兩者間差異無統(tǒng)計學差異(P0.05)；相對于PARP抑制劑組,聯(lián)合組細胞內p-AKT水平明顯降低。 結論 1.人雄激素抵抗性前列腺癌細胞株PC3不表達INPP4B。 2.轉染INPP4B基因能夠對PC3細胞發(fā)揮抗腫瘤作用。 3. PARP抑制劑單獨作用于PC3細胞能夠發(fā)揮抗腫瘤作用。 4.轉染INPP4B基因聯(lián)合PARP抑制劑在PC3細胞能夠發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤功能,有希望成為激素抵抗型前列腺癌聯(lián)合生物治療的靶點。
[Abstract]:Background Prostate cancer is one of the most common malignant tumors in the male urinary system . In Europe and America , prostate cancer accounts for the second largest cause of malignant tumor . In 2013 , 238,590 men have prostate cancer . In human prostate cancer , androgen receptor ( AR ) may not express AR , and the expression of INPP4B in prostate cancer tissue is reduced compared with normal tissue . In conclusion , it was attempted to observe whether the transfected INPP4B gene was able to downregulate the proliferation of PC3 cells while downregulating its p - level , and whether it could play a synergetic anti - tumor effect . Purpose The effect of transfection of INPP4B gene on the proliferation of androgen - resistant prostate cancer cell line PC3 was investigated . method The expression of INPP4B mRNA in PC3 cells was detected by reverse transcription polymerase chain reaction ( RT - PCR ) . The expression of INPP4B mRNA in PC3 cells was detected by RT - PCR . The expression of INPP4B mRNA was detected by Western blot . Results Compared with the Lenti - GFP group , there was significant difference between the two groups : ( 93.58 鹵 3.51 ) % , ( 43.88 鹵 3.02 ) % , ( 45.10 鹵 3.38 ) % , ( 29.35 鹵 3.19 ) % , ( 54.12 鹵 1.96 ) % , respectively . Conclusion 1 . The human androgen - resistant prostate cancer cell line PC3 did not express INPP4B . 2 . The transfected INPP4B gene can play an anti - tumor effect on PC3 cells . 3 . The inhibitor alone acts on PC3 cells to play an anti - tumor effect . 4 . The transfection of the INPP4B gene and the parp inhibitor can play a synergistic anti - tumor function in PC3 cells , and it is promising to be a target for the combination therapy of hormone - resistant prostate cancer .

【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.25

【參考文獻】

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本文編號：1523013