本文關(guān)鍵詞： 膀胱癌 mi R-26 HMGA1:q RT-PCR　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:膀胱癌的發(fā)病率在泌尿系惡性腫瘤中排第二位,其發(fā)病率和病死率在世界范圍內(nèi)逐年上升。中國人中膀胱癌是目前男性中發(fā)病率第8位,女性中第12位的高發(fā)惡性腫瘤,在泌尿生殖系統(tǒng)中位居首位;但是即使目前,我們尚未找到合適的標(biāo)志物分子,對(duì)分析膀胱癌的發(fā)病機(jī)制、診斷、治療提供幫助。膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素復(fù)雜的過程,涉及多個(gè)基因、多個(gè)途徑、多個(gè)環(huán)節(jié)的變化。micro RNA是一種小分子非編碼、單鏈RNA,長度約18-25核苷酸,是最近研究較多的標(biāo)的,可以在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá);研究發(fā)現(xiàn),在包括膀胱癌在內(nèi)的多數(shù)腫瘤存在特異性上調(diào)和/或下調(diào)的micro RNAs,它們一般都有自己特異性的靶基因,通過靶基因調(diào)控目標(biāo)蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)功能,在相對(duì)應(yīng)的腫瘤細(xì)胞的調(diào)控中發(fā)揮相應(yīng)的作用,。目的:本研究實(shí)時(shí)定量檢測驗(yàn)證了膀胱癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織中mi R-26及其可能的靶基因HMGA1的表達(dá)情況,對(duì)所預(yù)測的mi R-26的作用靶點(diǎn)基因HMGA1進(jìn)行了驗(yàn)證,并在膀胱癌細(xì)胞系T24中通過獲得性功能實(shí)驗(yàn)鑒定mi R-26的生物學(xué)功能。方法:1.獲取126組配對(duì)的人膀胱癌切除術(shù)后標(biāo)本,q RT-PCR檢測mi R-26和HMGA1(可能的靶基因)的表達(dá),統(tǒng)計(jì)mi R-26和可能的靶基因HMGA1在膀胱癌及癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)量差異,以及miR-26和可能的靶基因HMGA1與不同膀胱癌樣本的組織形態(tài)、臨床分期、病理分期及分級(jí)之間的關(guān)系;利用在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測mi R-26和可能的靶基因HMGA1的關(guān)系,應(yīng)用RNAi等技術(shù)干預(yù)后,驗(yàn)證靶蛋白表達(dá)量的變化(蛋白質(zhì)印跡法等),檢測mi R-26對(duì)下游靶序列的作用并進(jìn)行鑒定(雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng))。通過膀胱癌細(xì)胞株T24體外轉(zhuǎn)染mi R-26 mimic,以CCK-8、裸鼠成瘤等方法來進(jìn)行獲得性功能實(shí)驗(yàn),分析mi R-26過表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞T24的增殖、侵襲、周期的影響。結(jié)果:1.q RT-PCR檢測126例腫瘤組織標(biāo)本中,28例(22.22%)病例同時(shí)高表達(dá)的mi R-26和HMGA1 mRNA,30例(23.81%)例同時(shí)低表達(dá)miR-26和HMGA1 mRNA,28例(22.22%)mi R-26高表達(dá)而HMGA1低表達(dá),40例(31.75%)例mi R-26低表達(dá)而HMGA1高表達(dá)。Spearman’s相關(guān)分析結(jié)果,膀胱癌組織中mi R-26的表達(dá)水平與hmga1mrna表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.72,p0.001)。2.在高病理分期、分級(jí)和陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌組織中mir-26的表達(dá)水平均顯著低于病理分期早期(p=0.01),低病理級(jí)別的腫瘤(p=0.006),陰性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.02)。同時(shí),hmga1的表達(dá)水平在高病理分期、分級(jí),復(fù)發(fā)和陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌標(biāo)本中均顯著高于早期病理分期(p=0.01),低級(jí)別腫瘤(p=0.006)和無復(fù)發(fā)(p=0.02)。此外,同時(shí)有mir-26表達(dá)下調(diào)和hmga1表達(dá)上調(diào)的在高病理分期和高腫瘤級(jí)別標(biāo)本中差異顯著(兩者均p0.001)。3.mir-26和hmga1的表達(dá)量與無瘤生存期及總生存期顯著相關(guān)(四者均p0.001,log-rank檢驗(yàn))。不同mir-26a/hmga1表達(dá)量組合兩兩比較的結(jié)果表明,mir-26-low/hmga1-high組患者的無病生存期和總生存期之間和其他3組存在顯著性差異(3者均p0.001)。mir-26-low/hmga1-high組的預(yù)后最差。4.利用在線算法進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)hmga13’-utr的mrna包含一個(gè)mir-26a互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn),序列比對(duì)分析提示hmga1可能是mir-26a調(diào)控膀胱癌的靶基因。5.應(yīng)用特異性的rnai技術(shù)通過“減和增”功能來評(píng)估m(xù)ir-26a介導(dǎo)hmga1對(duì)腫瘤抑制效應(yīng)。定量qrt-pcr和westernblot實(shí)驗(yàn)表明沉默hmga1功能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞活性的下降,部分強(qiáng)制表達(dá)hmga1,很顯著減弱mir-26a的g1期阻滯作用,hmga1是mir-26a介導(dǎo)的對(duì)膀胱腫瘤抑制功能的關(guān)鍵調(diào)控因子。6.將包含mir-26a可能的結(jié)合位點(diǎn)的144個(gè)堿基序列的3’-utrhmga1,插入雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的的下游。轉(zhuǎn)染wt+mir-26的腫瘤細(xì)胞,與其他組比較其熒光素酶活性顯著降低。同時(shí),轉(zhuǎn)染突變型3’-utr的熒光素酶活動(dòng)不受mir-26的影響,我們推斷hmga1是mir-26的直接靶點(diǎn)。7.通過轉(zhuǎn)染mir-26mimic在t24細(xì)胞過表達(dá)mir-26;mir-26過表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的生長;流式細(xì)胞周期檢測提示經(jīng)過處理的t24細(xì)胞發(fā)生g1期阻滯;mir-26過表達(dá)同時(shí)可以抑制腫瘤細(xì)胞克隆形成和裸鼠體內(nèi)成瘤能力;經(jīng)轉(zhuǎn)染處理的膀胱癌細(xì)胞t24,劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell小室實(shí)驗(yàn)提示其侵襲和遷移下降。結(jié)論:1.與癌旁非腫瘤組織相比,mir-26的相對(duì)表達(dá)量在癌組織中顯著下調(diào),而hmga1的相對(duì)表達(dá)量則顯著上調(diào)。2.mir-26低表達(dá)和hmga1高表達(dá)與膀胱癌與病理分期、分級(jí)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后顯著相關(guān);同時(shí)mir-26低表達(dá)并hmga1高表達(dá)的預(yù)后最差。3.HMGA1是miR-26調(diào)控腫瘤生長的關(guān)鍵性蛋白,HMGA1是新確認(rèn)的mi R-26的標(biāo)靶。4.mi R-26在T24細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯和細(xì)胞增殖抑制。同時(shí)T24細(xì)胞的克隆形成和侵襲能力減弱。
[Abstract]:Background : The incidence of bladder cancer is the second place in the malignant tumor of the urinary system . The incidence and mortality of bladder cancer are increasing year by year in the world . However , even if we haven ' t found suitable marker molecules at present , it is a multi - factor complex process . It is a small molecule non - coding , single - stranded RNA with a length of about 18 - 25 nucleotides . It is a small molecule non - coding , single - stranded RNA . It has a length of about 18 - 25 nucleotides . It is a small molecule non - coding , single - stranded RNA . It can regulate gene expression after transcription . Objective : To investigate the expression of mi R - 26 and its possible target gene in bladder cancer cell line 24 by means of real - time quantitative detection of mi R - 26 and its possible target gene . log - rank test ) . The expression of mir - 26 was significantly lower than that in other groups .

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.14

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