發(fā)布時(shí)間：2018-02-20 03:14

  本文關(guān)鍵詞： HKC 凋亡HIPK2 HKC 凋亡 順鉑HKC細(xì)胞 microRNA 芯片 生物信息學(xué)　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分建立順鉑誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞(HKC細(xì)胞)凋亡模型目的建立順鉑誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞凋亡模型,選定下一步實(shí)驗(yàn)合適的順鉑濃度。方法向?qū)?shù)增長(zhǎng)期的HKC細(xì)胞加入順鉑使其在培養(yǎng)液濃度分別為2、10和50μM,對(duì)照組為同樣條件培養(yǎng)不加藥組。檢測(cè)HKC細(xì)胞存活率及凋亡率。結(jié)果HKC細(xì)胞存活率隨順鉑濃度升高下降,凋亡率隨順鉑濃度升高而升高。結(jié)論成功建立順鉑誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞凋亡模型;并將10 μM順鉑確定為下一步實(shí)驗(yàn)所需濃度。第二部分順鉑誘導(dǎo)HKC細(xì)胞凋亡中microRNA表達(dá)譜及生物信息學(xué)分析目的篩查順鉑誘導(dǎo)HKC細(xì)胞凋亡的microRNA差異表達(dá)譜及mRNA差異譜,結(jié)合生物信息學(xué)方法篩選靶基因及構(gòu)建Pathway-network,miRNAs-GO-network和miRNAs-Gene-network。進(jìn)一步確定在順鉑誘導(dǎo)HKC細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用的 microRNA。方法利用Affymetrix Gene Chip miRNA芯片進(jìn)行差異表達(dá)microRNA的篩選,分析獲得microRNA差異表達(dá)譜;同時(shí)利用Affymetrix U133基因表達(dá)芯片篩選差異表達(dá)mRNA。microRNA 靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)篩選差異microRNA靶基因,聯(lián)合基因表達(dá)芯片結(jié)果進(jìn)一步確定microRNA靶基因。生物信息學(xué)分析推測(cè)差異表達(dá)的microRNA可能具有的生物學(xué)功能及參與的機(jī)制通路,然后基于microRNA對(duì)靶基因的負(fù)向性調(diào)控,構(gòu)建 Pathway-network,miRNAs-GO-network 和miRNAs-Gene-network。根據(jù)以上網(wǎng)絡(luò),確定在順鉑誘導(dǎo)HKC細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用的miRNAs。結(jié)果差異表達(dá)的miRNAs聚類分析圖結(jié)果顯示各組組內(nèi)的樣本一致性較好。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組microRNA表達(dá)差異顯著(p0.05),共篩選出差異性表達(dá)的microRNA47條;AffymetrixU133基因芯片篩選出差異表達(dá)基因共3831條。利用microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出差異microRNA的靶基因4760個(gè),與基因芯片結(jié)果取交集后最終得到靶基因1181個(gè),如ARHGEF4和BNC2等。進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)方法得到分析網(wǎng)絡(luò):Pathway-network,miRNAs-GO-network和miRNAs-Gene-network,對(duì)network進(jìn)一步分析得出可能在順鉑誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用的microRNAs,如miR-9-3p和miR-371b-5p。結(jié)論經(jīng)順鉑誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞microRNA表達(dá)譜與對(duì)照組相比有明顯差異;miR-9-3p,miR-371b-5p可能在順鉑誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用。第三部分HIPK2對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞凋亡的影響目的探討HIPK2對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞凋亡的影響。方法首先構(gòu)建順鉑誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞凋亡模型,實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)HIPK2在不同濃度順鉑誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞凋亡過(guò)程中的表達(dá)。其次,設(shè)計(jì)合成兩條HIPK2siRNA干擾片段,通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HKC細(xì)胞,建立HIPK2干擾的細(xì)胞株,實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot方法分別檢測(cè)HIPK2 mRNA和蛋白的表達(dá),再用順鉑處理細(xì)胞,AnnexinV/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。最后,Western blot檢測(cè)干擾HIPK2對(duì)凋亡相關(guān)蛋白bax表達(dá)的影響。結(jié)果順鉑誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞凋亡過(guò)程中HIPK2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)(p0.05),且隨著順鉑濃度增高HIPK2表達(dá)逐漸降低。轉(zhuǎn)染小干擾RNA后可顯著降低HIPK2在HKC細(xì)胞內(nèi)mRNA和蛋白的表達(dá),且HIPK2表達(dá)降低后會(huì)促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞凋亡。結(jié)論HIPK2可抑制順鉑誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:In the first part , the apoptosis model of human renal tubular epithelial cells ( HKC cells ) induced by cisplatin was established to establish a cisplatin - induced apoptosis model of HKC cells .

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R692

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本文編號(hào)：1518630