本文關鍵詞： HKC 凋亡HIPK2 HKC 凋亡 順鉑HKC細胞 microRNA 芯片 生物信息學　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分建立順鉑誘導的人腎小管上皮細胞(HKC細胞)凋亡模型目的建立順鉑誘導的HKC細胞凋亡模型,選定下一步實驗合適的順鉑濃度。方法向?qū)?shù)增長期的HKC細胞加入順鉑使其在培養(yǎng)液濃度分別為2、10和50μM,對照組為同樣條件培養(yǎng)不加藥組。檢測HKC細胞存活率及凋亡率。結(jié)果HKC細胞存活率隨順鉑濃度升高下降,凋亡率隨順鉑濃度升高而升高。結(jié)論成功建立順鉑誘導的HKC細胞凋亡模型;并將10 μM順鉑確定為下一步實驗所需濃度。第二部分順鉑誘導HKC細胞凋亡中microRNA表達譜及生物信息學分析目的篩查順鉑誘導HKC細胞凋亡的microRNA差異表達譜及mRNA差異譜,結(jié)合生物信息學方法篩選靶基因及構(gòu)建Pathway-network,miRNAs-GO-network和miRNAs-Gene-network。進一步確定在順鉑誘導HKC細胞凋亡中發(fā)揮重要作用的 microRNA。方法利用Affymetrix Gene Chip miRNA芯片進行差異表達microRNA的篩選,分析獲得microRNA差異表達譜;同時利用Affymetrix U133基因表達芯片篩選差異表達mRNA。microRNA 靶基因數(shù)據(jù)庫篩選差異microRNA靶基因,聯(lián)合基因表達芯片結(jié)果進一步確定microRNA靶基因。生物信息學分析推測差異表達的microRNA可能具有的生物學功能及參與的機制通路,然后基于microRNA對靶基因的負向性調(diào)控,構(gòu)建 Pathway-network,miRNAs-GO-network 和miRNAs-Gene-network。根據(jù)以上網(wǎng)絡,確定在順鉑誘導HKC細胞凋亡中發(fā)揮重要作用的miRNAs。結(jié)果差異表達的miRNAs聚類分析圖結(jié)果顯示各組組內(nèi)的樣本一致性較好。與對照組相比,實驗組microRNA表達差異顯著(p0.05),共篩選出差異性表達的microRNA47條;AffymetrixU133基因芯片篩選出差異表達基因共3831條。利用microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫篩選出差異microRNA的靶基因4760個,與基因芯片結(jié)果取交集后最終得到靶基因1181個,如ARHGEF4和BNC2等。進一步通過生物信息學方法得到分析網(wǎng)絡:Pathway-network,miRNAs-GO-network和miRNAs-Gene-network,對network進一步分析得出可能在順鉑誘導的HKC細胞凋亡發(fā)揮重要作用的microRNAs,如miR-9-3p和miR-371b-5p。結(jié)論經(jīng)順鉑誘導的HKC細胞microRNA表達譜與對照組相比有明顯差異;miR-9-3p,miR-371b-5p可能在順鉑誘導的HKC細胞凋亡中發(fā)揮作用。第三部分HIPK2對順鉑誘導的HKC細胞凋亡的影響目的探討HIPK2對順鉑誘導的HKC細胞凋亡的影響。方法首先構(gòu)建順鉑誘導的HKC細胞凋亡模型,實時熒光定量PCR和Western blot檢測HIPK2在不同濃度順鉑誘導的HKC細胞凋亡過程中的表達。其次,設計合成兩條HIPK2siRNA干擾片段,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HKC細胞,建立HIPK2干擾的細胞株,實時熒光定量PCR和Western blot方法分別檢測HIPK2 mRNA和蛋白的表達,再用順鉑處理細胞,AnnexinV/PI檢測細胞凋亡情況。最后,Western blot檢測干擾HIPK2對凋亡相關蛋白bax表達的影響。結(jié)果順鉑誘導的HKC細胞凋亡過程中HIPK2 mRNA和蛋白表達水平均明顯下調(diào)(p0.05),且隨著順鉑濃度增高HIPK2表達逐漸降低。轉(zhuǎn)染小干擾RNA后可顯著降低HIPK2在HKC細胞內(nèi)mRNA和蛋白的表達,且HIPK2表達降低后會促進順鉑誘導的HKC細胞凋亡。結(jié)論HIPK2可抑制順鉑誘導的HKC細胞凋亡。
[Abstract]:In the first part , the apoptosis model of human renal tubular epithelial cells ( HKC cells ) induced by cisplatin was established to establish a cisplatin - induced apoptosis model of HKC cells .

【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R692

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