本文關(guān)鍵詞： 組蛋白去乙�；敢种苿� 丙戊酸 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 糖尿病腎病　出處：《吉林大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：糖尿病腎�。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病(diabetes mellitus，DM）微血管并發(fā)癥之一，是產(chǎn)生終末期腎衰竭（end stage renal disease，ESRD）的主要原因，嚴(yán)重威脅人們健康。人們認(rèn)為DN主要原因是腎小球基底膜細(xì)胞損傷等，但是，最近研究發(fā)現(xiàn)DN時(shí)腎小管上皮細(xì)胞也存在明顯的病理變化�？梢�，DN發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，需要對(duì)DN的機(jī)制及治療方法進(jìn)行研究。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是真核生物中與分泌途徑有關(guān)的重要的細(xì)胞器，它與蛋白的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)及翻譯后修飾密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔對(duì)外界刺激非常敏感，在缺血、缺氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗竭、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、氧化應(yīng)激等因素刺激下ER穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的產(chǎn)生。ERS時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白及未折疊蛋白堆積，ER通過未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）激活下游信號(hào)通路進(jìn)行自我調(diào)節(jié)以減輕或終止ERS，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。然而，當(dāng)刺激持久或強(qiáng)烈時(shí)，ERS不可逆轉(zhuǎn)，則啟動(dòng)ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑（ER-associated death，ERAD）導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，以ERS為治療靶點(diǎn)的研究越來越受到人們的關(guān)注。 糖尿病狀態(tài)下，高血糖、游離脂肪酸增多、氧化應(yīng)激等均是ERS的誘發(fā)因素，而DN是糖尿病晚期的慢性并發(fā)癥，這些不良因素長(zhǎng)期持久的刺激使ERS不可逆轉(zhuǎn)，最終啟動(dòng)ERAD并與其他細(xì)胞損傷機(jī)制串話，起到級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致器官的衰竭。因此，抑制ERS可能會(huì)改善DN的發(fā)生與發(fā)展。目前研究表明DN時(shí)ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)變化比較明確，但是這些蛋白的表達(dá)調(diào)控尚不清楚。 真核生物基因表達(dá)是完整復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程。真核生物基因表達(dá)調(diào)控包括基因組DNA水平的調(diào)控，其中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變對(duì)基因組DNA水平的調(diào)控影響較大。組蛋白乙酰化修飾與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變關(guān)系密切，可以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。組蛋白乙�；瘏⑴c細(xì)胞的增殖，遷移和凋亡。組蛋白乙�；c去乙酰化作用由組蛋白去乙�；福╤istone deacetylase，HDAC）與組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶（histone acetyl transferase，HAT）之間的動(dòng)態(tài)平衡決定。組蛋白去乙�；敢种苿╤istone deacetylases inhibitors，HDACIs）抑制HDAC，促進(jìn)組蛋白乙酰化，影響基因轉(zhuǎn)錄活性，因此在神經(jīng)退行性變，糖尿病，心血管疾病及自身免疫性疾病等方面均有廣泛的研究。丙戊酸（Valproic acid，VPA）是HDACIs代表藥物，可以非選擇性的抑制HDAC，已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HDACIs對(duì)腎損傷有一定的保護(hù)作用，并有研究表明HDAC與ERS相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。因此，我們推測(cè)HDACIs可能通過調(diào)控ERS相關(guān)蛋白的乙�；綔p輕糖尿病腎損傷。 本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究VPA對(duì)DN大鼠模型ERS、細(xì)胞凋亡及糖尿病腎損傷的影響，探討了VPA是否通過ERS及細(xì)胞凋亡干預(yù)DN；通過體外實(shí)驗(yàn)研究了VPA對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠NRK-52E細(xì)胞的ERS及細(xì)胞凋亡的影響；并在NRK-52E細(xì)胞和DN大鼠模型中初步探討VPA對(duì)DN的作用是否通過調(diào)控ERS相關(guān)基因的乙�；綇亩绊懟虻霓D(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)的。 方法： 在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中通過給予Wistar大鼠注射STZ后繼續(xù)高脂飼養(yǎng)22周，誘導(dǎo)形成DN模型,而后給予VPA灌胃8周后取材。對(duì)DN大鼠模型進(jìn)行了生化代謝指標(biāo)檢測(cè)、組織病理學(xué)形態(tài)及透射電鏡檢查明確VPA對(duì)DN大鼠模型腎損害的影響。采用免疫組化、免疫熒光及Western blot的方法檢測(cè)了ERS相關(guān)蛋白GRP78、CHOP及Caspase12的蛋白表達(dá)明確VPA對(duì)DN大鼠模型ERS的影響。采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及Western blot的方法檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白P-JNK，ATF4，Bcl-2，Bax，cleaved-Caspase3的蛋白表達(dá)明確VPA對(duì)DN大鼠模型細(xì)胞凋亡的影響。在體外實(shí)驗(yàn)中，選擇大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。用MTT法確定VPA的使用濃度。用Western blot方法檢測(cè)了ERS相關(guān)蛋白GRP78、CHOP及Caspase12的蛋白表達(dá)。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率及用Western blot方法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞凋亡蛋白P-JNK、ATF4、 Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3的表達(dá)水平。用比色法檢測(cè)VPA在高糖誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞及DN大鼠模型中組蛋白H4總乙酰化水平，用CHIP法檢測(cè)VPA在高糖誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞及DN大鼠模型中ERS相關(guān)蛋白GRP78及CHOP基因啟動(dòng)子組蛋白H4的乙酰化水平。 結(jié)果 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VPA可以使DN大鼠模型血肌酐降低，24小時(shí)尿蛋白明顯減少，但對(duì)大鼠模型的血糖、體重、腎重/體重的比值無影響。光鏡下觀察顯示，，DN大鼠模型腎小球體積變大，腎小球囊腔間隙縮小，腎小球基底膜不規(guī)則增厚，系膜基質(zhì)增多，部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)萎縮，VPA給藥后以使上述形態(tài)改變不同程度減輕。透射電鏡下觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)顯示，DN大鼠模型的腎小球基底膜明顯不規(guī)則增厚，濾過膜三層結(jié)構(gòu)不清晰，足突齒梳狀紊亂，間隙增寬，內(nèi)皮細(xì)胞呈“拱狀”增生，系膜基質(zhì)增多，可見大的吞噬泡。VPA給藥后上述超微結(jié)構(gòu)改變不同程度減輕。VPA可以增加DN大鼠模型GRP78、減少CHOP及Caspase12蛋白的表達(dá),且主要發(fā)生在腎小管上皮細(xì)胞處；VPA可以減輕DN大鼠模型的細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡也主要發(fā)生在腎小管上皮細(xì)胞處。VPA可以減少凋亡相關(guān)蛋白P-JNK, ATF4、Bax, cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)，增加Bcl-2的蛋白表達(dá)，Bcl-2/Bax的比值升高。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VPA可以增加高糖誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白GRP78的表達(dá)，降低CHOP及Caspase12的蛋白表達(dá)；減少NRK-52E細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率，減少凋亡相關(guān)蛋白P-JNK、ATF4、Bax、cleaved-Caspase3的蛋白表達(dá)，增加Bcl-2的蛋白表達(dá)。VPA可以使高糖誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞及DN大鼠模型組蛋白H4總乙�；矫黠@增高，并可以使NRK-52E細(xì)胞及DN大鼠模型中GRP78基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H4的乙酰化水平增高，CHOP基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H4的乙酰化水平減低。 結(jié)論： 1、大鼠注射STZ7天，血糖增加。22周后大鼠的24h蛋白尿、血肌酐明顯增加。腎小球體積增大、基底膜不規(guī)則增厚、腎小管細(xì)胞發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡等腎臟組織病理改變，提示發(fā)生了糖尿病腎損傷。 2、組蛋白去乙酰化酶抑制劑VPA改變了ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)，減輕了ERS，抑制細(xì)胞凋亡，表明了VPA可以減輕DN大鼠模型的腎損傷。 3、體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)VPA可以減輕高糖誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞的ERS，并減少其細(xì)胞凋亡。 4、體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明VPA對(duì)ERS的調(diào)控可能是通過調(diào)控ERS相關(guān)蛋白GRP78及CHOP基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白乙酰化水平實(shí)現(xiàn)的。 因此，以組蛋白去乙�；笧榘悬c(diǎn)的去乙�；敢种苿┛赡転镈N的治療提供一個(gè)新的選擇。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9

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本文編號(hào)：1513241