本文關(guān)鍵詞： 膀胱尿路上皮癌 EN2 RNAi 生物學(xué)行為 基因治療　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：膀胱癌是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅著人類健康。膀胱癌的病理組織學(xué)類型主要是尿路(移行)上皮癌。膀胱癌的病理分級與膀胱癌的復(fù)發(fā)和侵襲行為密切相關(guān),對膀胱癌預(yù)后的評估有重要的參考價值。按病理分級程度可把膀胱癌分為低度惡性傾向的尿路上皮乳頭狀腫瘤、低分級尿路上皮癌以及高分級尿路上皮癌。膀胱癌的病理分期指腫瘤浸潤深度及轉(zhuǎn)移的情況,既是判斷膀胱腫瘤預(yù)后最有價值的參數(shù),也是制定膀胱癌治療方案的重要依據(jù)。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟制定的第7版TNM分期法,可把膀胱癌分為非肌層浸潤性膀胱癌(包括Tis、Ta和T1期膀胱癌)和肌層浸潤性膀胱癌(包括等于或大于T2期的膀胱癌)。 目前,非肌層浸潤性膀胱癌的治療手段仍以經(jīng)尿道行膀胱腫瘤電切術(shù)及術(shù)后行膀胱灌注化療；而肌層浸潤性膀胱癌的治療手段主要為根治性的膀胱腫瘤切除術(shù),同時行盆腔淋巴結(jié)清掃及尿流改道術(shù)。然而,由于膀胱癌細(xì)胞群落呈現(xiàn)復(fù)雜的異質(zhì)性,生物學(xué)行為多變,盡管多數(shù)腫瘤都表現(xiàn)為NMIBC,卻仍然有多達(dá)80%的患者會在最初治療后的1～2年內(nèi)復(fù)發(fā)。對于MIBC,即使進(jìn)行根治性的膀胱切除并系統(tǒng)的放化療后,也會有50%的患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移。因此,進(jìn)一步探索膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,進(jìn)而開發(fā)新的有效的治療手段,仍是今后的重要課題。 RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種由小的雙鏈RNA分子誘導(dǎo),并能夠和與其序列互補(bǔ)的mRNA結(jié)合,從而使后者發(fā)生降解的現(xiàn)象。RNAi具有高效沉默特定基因的作用,是細(xì)胞本身固有的對抗外源基因侵害的一種自我保護(hù)現(xiàn)象,是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。利用RNAi技術(shù),將具有特定序列的小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi),可以引起同源序列mRNA的特異性降解,從而高效并特異地阻斷特定基因的表達(dá),使細(xì)胞出現(xiàn)特定基因缺失的表型,并進(jìn)而達(dá)到治療的目的,有希望廣泛應(yīng)用于腫瘤的基因治療。因此,利用RNAi技術(shù)封閉與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的基因或因子的表達(dá),必將改變膀胱癌治療的現(xiàn)狀,并成為更加高效和特異的手段。 同源異型盒基因是進(jìn)化中高度保守的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)序列。它們編碼的蛋白質(zhì)家族在動物胚胎發(fā)育過程中作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,繼母系基因、受精卵基因和分節(jié)基因之后,在每個節(jié)旁(parasegment)中的各種特定類型的細(xì)胞分化之前表達(dá),控制身體前后軸線上組成結(jié)構(gòu)中的基因表達(dá),從而形成嚴(yán)格的時空特異性表達(dá)模式,對于生物體胚胎體節(jié)和器官的發(fā)生及其相對位置的定位起著關(guān)鍵作用。除了控制胚胎細(xì)胞的分化和增殖以外,同源異型盒基因還在成人組織的發(fā)育和分化調(diào)控中起著重要作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn),同源異型盒基因在癌癥發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。當(dāng)同源異型盒基因表達(dá)異常時,在胚胎期可導(dǎo)致個體的發(fā)育和組織器官的形成出現(xiàn)異常,而在成年期可誘發(fā)細(xì)胞的惡性增殖,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。 Engrailed (EN)是同源異型盒基因之一,普遍存在于包括環(huán)節(jié)動物、軟體動物、昆蟲、棘皮動物、脊索動物及脊椎動物等各種動物門中。在脊椎動物中,由于特定功能的不同,EN又分為EN1和EN2；在發(fā)育過程中,兩種EN功能具有互補(bǔ)性。 EN2是一個高度保守的同源異型盒基因,廣泛存在于各種動物中,在胚胎發(fā)育過程中,特別是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起著重要的作用,可能參與了發(fā)育中組織特定區(qū)域的空間完整性的建立與維持。近年來研究發(fā)現(xiàn),EN2在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用,可能具有原癌基因的作用。 然而,目前對于EN2在人膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚研究不多。本課題采用本課題通過采用免疫組織化學(xué)、Western blot、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)及實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reactionq, qRT-PCR)等技術(shù)研究EN2蛋白和基因在膀胱尿路上皮癌組織、膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系中的表達(dá)；并通過RNAi技術(shù)抑制EN2基因的表達(dá),進(jìn)一步研究EN2對膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲等方面的影響；從而探討EN2在膀胱尿路上皮癌發(fā)生、發(fā)展中的作用,并為膀胱尿路上皮癌的治療提供新思路。第一部分EN2在膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá) 目的：EN2是一種同源異型盒基因,在一些腫瘤中呈高表達(dá),可能具有癌基因的作用,但在膀胱癌中的作用如何,目前研究較少。本研究旨在探討EN2蛋白和基因在人膀胱尿路上皮癌組織和正常膀胱粘膜組織中的表達(dá)情況,初步明確EN2在膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展中的作用。 方法：采集2012年1月至2012年12月手術(shù)切除的膀胱尿路上皮癌組織標(biāo)本(n=60)作為實驗組；因膀胱慢性黏膜炎行膀胱鏡檢而采集的膀胱粘膜組織作為對照組(n=10)。所獲組織分為兩部分,一部分用于免疫組織化學(xué)檢測,另一部分用于western blot和RT-PC檢測。 結(jié)果：免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)EN2蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞漿,細(xì)胞核內(nèi)也有少量表達(dá)。膀胱尿路上皮癌組織中EN2蛋白的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常膀胱組織(P0.05),并且隨病理分級和分期的增加,EN2蛋白的表達(dá)強(qiáng)度也明顯增加,呈現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系；另外,不同病理分期和病理分級的膀胱尿路上皮癌組織之間的EN2蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與性別無明顯關(guān)系(P0.05)。Spearman等級相關(guān)分析顯示病理分期為T2期的膀胱尿路上皮癌組織中,EN2蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與年齡存在正相關(guān)關(guān)系,即在T2期膀胱尿路上皮癌患者中,EN2蛋白的表達(dá)強(qiáng)度有隨年齡增大而增強(qiáng)的趨勢(P0.05)；而Ta及T1期膀胱尿路上皮癌患者的年齡則與EN2蛋白的表達(dá)強(qiáng)度無明顯相關(guān)性(P0.05)。另外,western blot和RT-PCI檢測結(jié)果與免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果一致,即隨病理分級、分期的增加,膀胱尿路上皮癌組織中的EN2蛋白和基因的相對表達(dá)量也明顯增加(P0.05)。 結(jié)論：EN2蛋白主要表達(dá)于膀胱尿路上皮細(xì)胞的細(xì)胞漿,細(xì)胞核內(nèi)也有少量表達(dá)。膀胱尿路上皮癌組織中EN2蛋白和基因的表達(dá)明顯高于正常膀胱組織,其蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與膀胱尿路上皮癌的病理分級、分期及T2期膀胱尿路上皮癌的年齡呈正相關(guān)關(guān)系；而與性別及Ta和T1期膀胱尿路上皮癌患者的年齡沒有明顯無關(guān)。 第二部分EN2在人膀胱癌不同細(xì)胞系中表達(dá)的研究 目的：在初步明確EN2在膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)情況后,進(jìn)一步探討EN2蛋白和基因在人三種人膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系和人正常膀胱上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況,篩選出EN2表達(dá)水平最高的尿路上皮癌細(xì)胞系。 方法：體外培養(yǎng)三種惡性程度不同的膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系(EJ、T24及RT4)和一種正常膀胱尿路上皮細(xì)胞(SV-HUC-1),采用ELISA法、Western blot、 qRT-PCR方法檢測膀胱尿路上皮癌不同細(xì)胞系的EN2表達(dá)情況。 結(jié)果：ELISA和Western blot檢測發(fā)現(xiàn),膀胱尿路上皮癌細(xì)胞的EN2蛋白表達(dá)明顯高于正常膀胱尿路上皮細(xì)胞(P0.05)。在三種膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系中,以EJ細(xì)胞系的EN2蛋白水平表達(dá)最高,其次為T24細(xì)胞系,再次為RT4細(xì)胞系,正常膀胱尿路上皮細(xì)胞中也有少量EN2蛋白表達(dá)(P0.05)。另外,ELISA法也在三種膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系培養(yǎng)基的上清液中檢測到不同濃度的EN2蛋白,其水平仍以EJ細(xì)胞系的培養(yǎng)基最高,其次為T24細(xì)胞系的培養(yǎng)基,再次為RT4細(xì)胞系的培養(yǎng)基；而正常膀胱尿路上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液中僅檢測到微量水平的EN2蛋白(P0.05)。進(jìn)一步利用qRT-PCR技術(shù)檢測EN2mRNA的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系的EN2mRNA表達(dá)水平明顯高于正常膀胱尿路上皮細(xì)胞系,而正常膀胱尿路上皮細(xì)胞中僅有少量EN2基因的表達(dá)；而且,不同的膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系中,EN2mRNA的表達(dá)水平也明顯不同,其中,以EJ細(xì)胞系的EN2mRNA表達(dá)水平最高,其次為T24細(xì)胞系,再次為RT4細(xì)胞系。 結(jié)論：與正常的膀胱尿路上皮細(xì)胞系相比,各種膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系的EN2蛋白和基因的表達(dá)水平均明顯上調(diào)；但在不同惡性程度的膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系中,EN2蛋白和基因的表達(dá)水平不同,即惡性程度低的膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系中EN2蛋白和基因的表達(dá)水平較低,而惡性程度高的膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系中EN2蛋白和基因的表達(dá)水平較高。另外,EN2蛋白可能以分泌、漏出或其他的方式進(jìn)入到細(xì)胞外環(huán)境,從而可能進(jìn)一步進(jìn)入尿液。 第三部分RNA干擾EN2基因表達(dá)對膀胱尿路上皮癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 目的：在明確了EN2蛋白和基因在膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用RNAi技術(shù),以化學(xué)合成的特異性siRNA抑制EN2基因的表達(dá),檢測EN2基因受到抑制后,膀胱尿路上皮癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力以及細(xì)胞凋亡等生物學(xué)行為的變化,從而進(jìn)一步探討EN2在膀胱尿路上皮癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。 方法：選取第二部分實驗中確定的EN2表達(dá)水平最高的膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系(EJ細(xì)胞系)作為研究對象,以化學(xué)合成法合成針對EN2的三對特異性siRNA和一對陰性對照的siRNA,并成功轉(zhuǎn)染至EJ細(xì)胞內(nèi)。以倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,確定最佳轉(zhuǎn)染濃度；以qRT-PCR檢測成功轉(zhuǎn)染三對siRNA后的EJ細(xì)胞的EN2mRNA表達(dá)水平,確定抑制效果最佳的一對siRNA。以激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染siRNA后的EN2蛋白表達(dá)情況；以Western blot、qRT-PCR技術(shù)分別檢測轉(zhuǎn)染siRNA后的EN2蛋白和基因的表達(dá)情況；同時,以MTS法、細(xì)胞侵襲實驗檢測EJ細(xì)胞的增殖和侵襲能力,并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果：轉(zhuǎn)然后48小時,激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,EN2蛋白主要表達(dá)在EJ細(xì)胞的胞漿,胞核也有少量表達(dá),陽性細(xì)胞可見胞漿和(或)胞核被染成綠色,空白對照組的細(xì)胞沒有被染色；干擾組的熒光強(qiáng)度值明顯低于未干擾組(P0.05),即EN2蛋白表達(dá)明顯降低,抑制率為(50.99±0.01)%。成功轉(zhuǎn)染siRNA至EJ細(xì)胞系24小時和48小時后,qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果分別顯示,與陰性對照組和未干擾組相比,轉(zhuǎn)染組EJ細(xì)胞的EN2基因和蛋白的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯下調(diào)(P0.05)。MTS法檢測細(xì)胞增殖能力發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染siRNA后24h,轉(zhuǎn)染組EJ細(xì)胞的OD值與陰性對照組和未干擾組相比未見明顯差異(P0.05),其增殖能力未受明顯影響(P0.05)；轉(zhuǎn)染siRNA后48h,干擾組EJ細(xì)胞的OD值明顯低于陰性對照組和未干擾組,抑制率迅速上升到27.85%；轉(zhuǎn)染72h后,抑制率進(jìn)一步上升,達(dá)到43.02%；說明EJ細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制(P0.05)。侵襲實驗結(jié)果顯示,未干擾組和陰性對照組的EJ細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為29.27±4.08個和29.47±3.18個,兩者相比,侵襲細(xì)胞數(shù)無明顯差異(P0.05)；而干擾組EJ細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)則僅為5.13±1.68個,明顯少于未干擾組和陰性對照組(P0.05)；這說明轉(zhuǎn)染siRNA后,EJ細(xì)胞的侵襲能力受到顯著抑制。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染48h后,與未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率明顯增加(P0.05)。轉(zhuǎn)染組EJ細(xì)胞早期凋亡率為9.72±0.58%；晚期凋亡率為8.46±0.62%；總凋亡率為18.19±×1.21%；與未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染組的凋亡細(xì)胞所占比例明顯增加(P0.05)。相反,與未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染組的活細(xì)胞比例明顯降低(P0.05)。 結(jié)論：以EN2的特異性siRNA轉(zhuǎn)染膀胱尿路上皮癌細(xì)胞,可明顯下調(diào)膀胱尿路上皮癌細(xì)胞中EN2的表達(dá),從而明顯抑制膀胱尿路上皮癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力,并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。因此,EN2有望成為膀胱癌治療的新靶點,尤其為將來膀胱癌的基因治療提供了一條新的研究途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.14

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1509564