本文關(guān)鍵詞： 前列腺癌 長鏈非編碼RNA 腫瘤轉(zhuǎn)移 EPHA5　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：【研究背景與目的】前列腺癌(prostate cancer,PCa)是一種嚴(yán)重威脅男性健康的惡性腫瘤,占全球腫瘤發(fā)病率第二位、死亡率第六位[1]。我國PCa的發(fā)病率近年來一直處于顯著的上升趨勢。來自北京、上海、廣州等發(fā)達(dá)城市的統(tǒng)計資料顯示。在男性泌尿生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤中,PCa的發(fā)病率已居于首位。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,中國前列腺癌發(fā)病率的增幅巨大,從1993年每10萬男性人口1.71例在2005年時已經(jīng)增加到了每10萬男性人口7.9例,平均年增幅高達(dá)13%[2]。按照這樣的數(shù)據(jù)計算,在2020年的時候,我國PCa的發(fā)病率水平會接近歐美水平,達(dá)到每10萬男性人口40例!與西方發(fā)達(dá)國家不同的是,我國前列腺癌發(fā)現(xiàn)時分期偏晚,腫瘤已經(jīng)局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,且低分化腫瘤占比高[3]。目前尚無確切分子機(jī)制能夠闡明前列腺癌轉(zhuǎn)移,也沒有相關(guān)靶標(biāo)能夠有效地預(yù)測前列腺癌轉(zhuǎn)移。因此,關(guān)于前列腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制一直是此腫瘤領(lǐng)域研究重點(diǎn)。針對這一問題,從以往的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白翻譯水平均未能深入闡明這些問題,需要通過新的角度來深入探索,以闡明前列腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。基因組學(xué)研究表明,哺乳動物基因組僅不到2%轉(zhuǎn)錄翻譯為蛋白質(zhì),超過98%轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA(non-coding RNA,nc RNA)[4]。nc RNA按其分子大小可分為小非編碼RNA(small nc RNA)和長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,Lnc RNA)。Lnc RNA被定義為長度超過200nt,不具備編碼蛋白的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。最初,Lnc RNA被認(rèn)為不具有生物學(xué)功能,僅僅是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物。因?yàn)槠浔磉_(dá)豐度通常較m RNA低,因而被當(dāng)成轉(zhuǎn)錄的“噪音”。但隨著研究的進(jìn)展,人們發(fā)現(xiàn)Lnc RNA可以以RNA形式參與基因組印記以及染色質(zhì)修飾,轉(zhuǎn)錄激活,轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,蛋白功能調(diào)節(jié)等多種重要的調(diào)控過程,即使這樣,Lnc RNA仍有許多功能尚未被了解。Lnc RNA的失調(diào)成為多種腫瘤的特征之一,它與腫瘤的關(guān)系成為近年的研究熱點(diǎn),Lnc RNA的出現(xiàn)也為揭示惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移特征提供了重要契機(jī)[5]。目前已有報道研究Lnc RNA在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用。Lnc RNA-ATB的表達(dá)能促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)腫瘤侵襲,并穩(wěn)定IL-11 m RNA影響腫瘤定植從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[6]。HOTAIR它能同時結(jié)合PRC2和LSD1/REST,并介導(dǎo)這2種復(fù)合體結(jié)合到特異性的基因組位點(diǎn),抑制相關(guān)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的表達(dá),促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[7]。這些研究結(jié)果表明,相對于腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì),Lnc RNA可能是更為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)移相關(guān)因子,這為腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究開辟了一個全新的視角。因此,本博士研究課題主要圍繞前列腺癌進(jìn)展相關(guān)長鏈非編碼RNA展開,旨在進(jìn)一步了解Lnc RNAs在前列腺癌轉(zhuǎn)移中所充當(dāng)?shù)慕巧?揭示惡性腫瘤轉(zhuǎn)移本質(zhì),為前列腺癌的治療提供新的視角和靶點(diǎn)。我們前期獲取66對臨床樣本前列腺癌患者的組織樣本,分別對癌及癌旁組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組深度測序。在發(fā)現(xiàn)癌與癌旁差異表達(dá)Lnc RNAs的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對腫瘤進(jìn)行分層(分化評分,T分期及是否轉(zhuǎn)移)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。成功鑒定出17條前列腺癌進(jìn)展相關(guān)的Lnc RNAs。而ENST00000503625(Lnc RNA625)在體外實(shí)驗(yàn)中能夠明顯抑制前列腺癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移表型。第一部分:前列腺癌進(jìn)展相關(guān)長鏈非編碼RNA的篩選和鑒定目的:發(fā)現(xiàn)中國人前列腺癌進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵Lnc RNA,為前列腺癌的治療提供新的視角和靶點(diǎn)。方法:(1)收集在我院行前列腺癌根治手術(shù)的患者的癌及癌旁組織標(biāo)本66對。(2)送測序公司進(jìn)行RNA測序。(3)篩選癌及癌旁差異表達(dá)的Lnc RNAs。(4)根據(jù)患者臨床信息進(jìn)行分層分析,篩選前列腺癌進(jìn)展相關(guān)的Lnc RNAs,確定研究對象。(5)確定目標(biāo)Lnc RNA在前列腺癌中與臨床特征的關(guān)系。(6)鑒定Lnc RNA的編碼能力,及全長序列。結(jié)果:(1)經(jīng)過患者同意并通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后,順利完成臨床組織樣本的收集。(2)妥善保存的組織送測序公司抽提總RNA后順利通過質(zhì)控,完成上機(jī)。(3)篩選出癌及癌旁組織差異表達(dá)的Lnc RNAs 439條,其中188上調(diào),251下調(diào)。(4)進(jìn)一步分析患者的臨床特征,成功鑒定出17條前列腺癌進(jìn)展相關(guān)Lnc RNAs。并輔助應(yīng)用公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析,確定將ENST00000503625作為研究對象。(6)ENST00000503625與前列腺癌的臨床特征相關(guān);(7)通過Coding Potential Calclator(CPC)algorithm計算確認(rèn)Lnc RNA625沒有不具有編碼能力。(8)通過RACE實(shí)驗(yàn)成功獲得Lnc RNA625的全長序列,證實(shí)Lnc RNA625與其上游轉(zhuǎn)錄EPHA5-AS1實(shí)為同一條轉(zhuǎn)錄。結(jié)論:我們通過大樣本的臨床樣本收集并進(jìn)行測序,并對測序數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行深度挖掘,同時輔助以生物信息學(xué)分析方法,最終通過一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了一條全新的Lnc RNA。并經(jīng)過分析,Lnc RNA625與前列腺癌臨床特征關(guān)系密切,且與預(yù)后相關(guān)。運(yùn)用在線Lnc RNA編碼能力計算系統(tǒng)確認(rèn)其不具有編碼能力并用實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證了Lnc RNA625與EPHA5-AS1是同一條轉(zhuǎn)錄。第二部分:Lnc RNA625能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移侵襲表型目的:明確特異性篩選出的Lnc RNA625在前列腺中的具體作用。方法:(1)Lnc RNA625的有效干擾RNA篩選。(2)選取高表達(dá)Lnc RNA625的細(xì)胞系進(jìn)行下調(diào)表達(dá)的功能實(shí)驗(yàn)。(3)分別用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期、Ed U摻入實(shí)驗(yàn)、cck-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖;用Annexin-V/PI雙染標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的變化;Transwell及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移及侵襲能力的改變。結(jié)果:(1)成功篩選出2條具有較強(qiáng)干擾效率的si RNA,敲除效率在70%以上。(2)明確Lnc RNA625的細(xì)胞分布,其中LNCa P、22Rv1為高表達(dá)Lnc RNA625的細(xì)胞系,確定作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的主要細(xì)胞系。(3)敲低Lnc RNA625后能夠顯著提升細(xì)胞的遷移和侵襲能力,然而Lnc RNA625的下調(diào)表達(dá)對細(xì)胞增殖活力及凋亡的影響不顯著。結(jié)論:Lnc RNA625作為胞漿定位的Lnc RNA能夠被si RNA有效的敲除,在細(xì)胞系的分布與細(xì)胞的惡性程度相關(guān)。并且改變Lnc RNA625的表達(dá)量能夠增強(qiáng)細(xì)胞的遷移及侵襲能力,而不影響細(xì)胞的增殖及凋亡。第三部分:Lnc RNA625影響抑癌蛋白EPHA5的表達(dá)目的:明確Lnc RNA625抑制前列腺癌轉(zhuǎn)移能力的具體分子機(jī)制方法:(1)通過序列分析尋找Lnc RNA625的可能靶基因。(2)明確Lnc RNA625與靶基因的變化關(guān)系,確認(rèn)靶基因受到Lnc RNA625的調(diào)控。(3)通過Rescue實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Lnc RNA625通過靶基因EPHA5發(fā)揮作用。(4)探索Lnc RNA625影響靶基因的可能機(jī)制。結(jié)果:(1)通過序列比對,預(yù)測抑癌蛋白EPHA5可能是Lnc RNA625的影響靶點(diǎn)。(2)通過分析組織、細(xì)胞中Lnc RNA625與EPHA5蛋白的相關(guān)性,及改變Lnc RNA625表達(dá)水平后EPHA5蛋白的變化,證實(shí)了EPHA5的含量受到Lnc RNA625的調(diào)控。(3)通過干擾Lnc RNA625后再過表達(dá)EPHA5的Recsue實(shí)驗(yàn)證實(shí)Lnc RNA625確實(shí)通過EPHA5發(fā)揮作用。(4)核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)、FISH證實(shí)了Lnc RNA625是主要定位細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的長鏈非編碼RNA。(5)通過m RNA半衰期實(shí)驗(yàn)說明Lnc RNA625通過保護(hù)EPHA5的m RNA而對EPHA5的表達(dá)水平起調(diào)節(jié)作用。結(jié)論:Lnc RNA625實(shí)為EPHA5 m RNA的反義鏈,而EPHA5蛋白在是前列腺癌中的抑癌蛋白。通過實(shí)驗(yàn)手段,證明了EPHA5是Lnc RNA625的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。Lnc RNA625通過其5’端的序列與EPHA5 m RNA互補(bǔ),在細(xì)胞漿中保護(hù)并延緩EPHA m RNAa的降解,從而影響EPHA5蛋白水平。小結(jié)本研究起步于大樣本高通量RNA測序數(shù)據(jù),圍繞前列腺癌進(jìn)展相關(guān)的Lnc RNA展開。通過分析前列腺癌組織與癌旁組織的差異表達(dá),并分類不同的腫瘤分期、分級,發(fā)現(xiàn)了在前列腺癌進(jìn)展過程中下調(diào)表達(dá)的Lnc RNA ENST00000503625(Lnc RNA625),公共數(shù)據(jù)分析顯示Lnc RNA625是前列腺癌生化復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測因素。腫瘤的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明,Lnc RNA625能夠?qū)η傲邢侔┘?xì)胞的遷移和侵襲能力發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,而不影響細(xì)胞的增殖和凋亡。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),Lnc RNA625能夠影響前列腺癌中的抑癌蛋白EPHA5,并用實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)了Lnc RNA625對EPHA5蛋白的調(diào)控作用及驗(yàn)證了EPHA5蛋白是Lnc RNA625發(fā)揮作用的中間分子。最后證實(shí)了Lnc RNA625通過序列互補(bǔ),在胞漿中延緩了EPHA5m RNA的降解。通過本研究,為前列腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供新的監(jiān)測標(biāo)志物,為解析前列腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制,優(yōu)化抗腫瘤策略提供新靶點(diǎn)和新策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 韓蘇軍;張思維;陳萬青;李長嶺;;中國前列腺癌發(fā)病現(xiàn)狀和流行趨勢分析[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2013年04期

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本文編號：1503856