本文關(guān)鍵詞： PCAF 腎上腺皮質(zhì)癌 增殖 凋亡 血管生長　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：[背景] 腎上腺皮質(zhì)癌(adrenocortical carcinoma, ACC)是原發(fā)于腎上腺皮質(zhì)的惡性腫瘤,臨床罕見,約占全身惡性腫瘤的0.02%。ACC惡性程度高,侵襲能力強(qiáng),早期診斷困難。目前采用改良的Weiss鑒別腎上腺皮質(zhì)良惡性腫瘤,但腎上腺皮質(zhì)腺瘤和ACC的組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)相似,在沒有周圍組織浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移征象時,病理診斷也難區(qū)分腎上腺皮質(zhì)癌和腎上腺皮質(zhì)腺瘤,故臨床上出現(xiàn)誤診的病例也不少見。ACC早期即可出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,術(shù)后復(fù)發(fā)率高,平均生存期約18個月。缺乏有效的藥物治療,根治性切除腫瘤仍然是國內(nèi)外治療ACC的首選治療方式。雖然在生物分子領(lǐng)域?qū)CC的發(fā)病機(jī)制取得了一定的成就,臨床病例所得的ACC患者血清學(xué)標(biāo)志,基因突變等指標(biāo)也有新的進(jìn)展,但仍未發(fā)現(xiàn)ACC的特異性靶基因,沒有找到準(zhǔn)確的治療靶點,這也是ACC診斷和治療的一個難點。 腎上腺皮質(zhì)癌是一個多基因相關(guān)腫瘤,涉及多條信號通路,發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,且因人種和地區(qū)等因素差異而表現(xiàn)不同。目前明確的發(fā)病機(jī)制有兩種,其一為Li-Fraumeni綜合征,一種罕見的家族性綜合征,與廣譜的腫瘤如乳腺癌、腎上腺皮質(zhì)癌、白血病等有關(guān),是由于基因突變導(dǎo)致抑癌基因P53的失活,從而促進(jìn)腫瘤的形成。其二為Beckwith-Wiedemann綜合征伴發(fā)疾病,該綜合征主要原因是發(fā)育缺陷,表現(xiàn)為臍膨出,巨大舌和身體一側(cè)生長過剩,少部分患兒伴發(fā)腎母細(xì)胞瘤、肝母細(xì)胞瘤、腎上腺皮質(zhì)癌等腫瘤�；蛲蛔兊奈恢脼�1lp15,該位點的基因包括IGF-2, H19, and p57Kip2。也有證據(jù)表明ACC中APC抑癌基因突變,與胃腸道腫瘤綜合征-腺瘤性息肉病(APC)發(fā)病機(jī)制相同。Gicquel等研究發(fā)現(xiàn),腫瘤突變的位點為17p(包含p53基因)及11p15(包含IGF-2/CDKN1C基因),而且這些突變與良惡性相關(guān),缺失17p和重組llp15與惡性表型有顯著相關(guān),可以作為區(qū)分良惡性腫瘤的重要指標(biāo)。IGF-2基因及其靶向分子藥物是目前研究散發(fā)性ACC靶向治療的主體,其中GALACCTIC研究就是針對IGF1R而進(jìn)行的一個135例樣本的系統(tǒng)研究。但上述研究所發(fā)現(xiàn)的與ACC發(fā)生發(fā)展可能相關(guān)基因的研究仍然比較模糊,對ACC的診斷治療無明顯臨床價值,所以尋找可靠靶點對ACC的診斷和治療仍然十分重要。 PCAF (P300/CBP Associated Factor)為共激活輔因子核蛋白,是重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白,能于多種基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子和多種DNA結(jié)合因子聯(lián)結(jié)相互作用,介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄,起橋梁、支架和乙�；D(zhuǎn)移酶作用。PCAF基因在腫瘤中的研究尚是一個新的領(lǐng)域,目前的研究表明,PCAF參與細(xì)胞分化、凋亡與腫瘤形成,同時PCAF可能參與腫瘤血管的生成以及腫瘤細(xì)胞的遷移,部分腫瘤中PCAF活性受到抑制,而也有腫瘤中報道PCAF在腫瘤中呈高表達(dá)。所以PCAF與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系仍處于爭議中。 關(guān)于PCAF的基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)PCAF是腫瘤抑制基因p53的共激活子,PCAF通過組蛋白乙�；Y(jié)合的p53和含有p53靶啟動子的組蛋白轉(zhuǎn)化激活p53的靶基因。有學(xué)者運(yùn)用微陣列技術(shù)方法發(fā)現(xiàn)PCAF在一組乳腺癌細(xì)胞系中可以被p53所誘導(dǎo)。兩種p53突變的乳腺癌細(xì)胞系BT-549和UACC-1179用于研究野生型p53誘導(dǎo)的PCAF,通過Real-time PCR的方法證實PCAF的表達(dá)被p53的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)所誘導(dǎo),并呈時間依賴性。染色質(zhì)免疫沉淀實驗顯示PCAF的誘導(dǎo)與p53與PCAF啟動子的結(jié)合具有相關(guān)性,而這些啟動子區(qū)含有p53的共結(jié)合位點。P53活動所誘導(dǎo)的PCAF的表達(dá)在p53野生型的MCF10A細(xì)胞系中得到證實。實驗發(fā)現(xiàn),PCAF的表達(dá)被內(nèi)源性的野生型p53通過劑量和時間依賴性的方式所誘導(dǎo)。針對p53的mRNA對MCF10A進(jìn)行預(yù)處理,可以發(fā)現(xiàn)柔紅霉素所誘導(dǎo)的PCAF的表達(dá)增加。簡言之,PCAF的表達(dá)可以被野生型P53所誘導(dǎo)。 同時p53抑制腫瘤細(xì)胞的功能需要DNA損傷和缺氧環(huán)境的作用,缺氧條件下p53激活由P300/CBP作用的的K382位點減弱,而PCAF作用的K320位點增強(qiáng),使K320位點激活的P53可以結(jié)合p21WAF-1/cip-1基因啟動子,促進(jìn)它的轉(zhuǎn)錄,但不能結(jié)合P53下游的凋亡基因BID啟動子。在缺氧條件下PCAF還通過乙�；せ頗IF-1α基因,為細(xì)胞提供能量,促進(jìn)細(xì)胞的增殖,推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。總之PCAF在缺氧條件下通過乙�；疨53和HIF-1α之間的平衡,來維持細(xì)胞周期阻滯和凋亡的平衡。PCAF還可以調(diào)節(jié)尿路上皮癌細(xì)胞(KK47、T24)中Y-box binding protein-1(YB-1)基因的轉(zhuǎn)錄, Masaki Shiota等敲除PCAF基因后發(fā)現(xiàn)YB-1表達(dá)水平下調(diào),抑制癌細(xì)胞的增殖和降低癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。該研究選擇的是順鉑不敏感的腫瘤細(xì)胞,并推測PCAF、YB-1可能作為這些腫瘤治療的靶點。 近幾年臨床腫瘤標(biāo)本中發(fā)現(xiàn),PCAF在多種腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞系中呈表達(dá)降低或不表達(dá),包括食管鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、肝癌等,PCAF表達(dá)降低或不表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系包括：Ovmana、OVI-P等,而造成PCAF表達(dá)降低的原因包括基因組的雜合性缺失、啟動子的甲基化及突變等。而PCAF在小兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、腎母細(xì)胞瘤以及前列腺癌等中高表達(dá),可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有促進(jìn)作用。這可能與PCAF可激活腫瘤中VEGF及HIF-1α通路,從而促進(jìn)腫瘤的增殖生長。 綜合最新的研究進(jìn)展,PCAF是細(xì)胞內(nèi)的一種乙�；D(zhuǎn)移酶,主要作用是乙�；M蛋白。通過激活組蛋白的相關(guān)位點來促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄,但所激活的基因中既有抑癌基因,又有原癌基因。上述從基礎(chǔ)研究到臨床標(biāo)本的研究可以發(fā)現(xiàn),PCAF所激活的基因隨腫瘤的不同而不同。 本研究基于此研究背景,檢測腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞株中PCAF的表達(dá)水平,建立過表達(dá)或干擾的穩(wěn)定細(xì)胞株后分別在細(xì)胞水平、分子水平、蛋白水平檢測PCAF對腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞的影響,并探討其作用機(jī)制。 [目的] 構(gòu)建pLentii6.3-PCAF慢病毒重組載體,建立PCAF下調(diào)的穩(wěn)定細(xì)胞株。觀察其對腎上腺皮質(zhì)癌SW-13細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡及侵襲等的影響。篩選相關(guān)基因并進(jìn)行熒光定量PCR分析和Western blot驗證,并對相關(guān)基因進(jìn)行組蛋白CHIP實驗驗證,探索相關(guān)信號通路的調(diào)控機(jī)制。 [方法] 1.選取15例廣州軍區(qū)總醫(yī)院腎上腺皮質(zhì)癌石蠟病理切片,6例正常腎上腺組織及32例腎上腺皮質(zhì)腺瘤進(jìn)行免疫組化實驗檢測PCAF的表達(dá)情況,采用秩和檢驗統(tǒng)計結(jié)果。另外取腎上腺皮質(zhì)癌的手術(shù)標(biāo)本,與正常的腎上腺皮質(zhì)腺瘤對照進(jìn)行qPCR檢測。 2.構(gòu)建含PCAF干擾序列的慢病毒載體pLentii6.3-PCAF,通過病毒感染進(jìn)入細(xì)胞株,經(jīng)過抗性篩選建立PCAF下調(diào)的穩(wěn)定細(xì)胞株,western blot及qPCR檢測均見實驗組、陰性對照組及空白對照組PCAF表達(dá)情況。 3.設(shè)立空白組、陰性對照組(轉(zhuǎn)染pLentii6.3載體)及實驗組(轉(zhuǎn)染pLentii6.3-PCAF載體)3組,進(jìn)行細(xì)胞增殖能力檢測、細(xì)胞周期檢測、細(xì)胞凋亡檢測及細(xì)胞遷移、侵襲能力檢測。 4.通過上述的檢測結(jié)果篩選出相關(guān)的蛋白及通路進(jìn)行western blot及qPCR檢測三組水平的變化。檢測beta-catenin、CD44、MMP-7, P53、PUMA、BAX、 BCL-2、Caspase-9, VEGF-A、HIF-1α、cyclinA、cyclinB、cyclinD1、cyclin El在對照組和實驗組間出現(xiàn)相應(yīng)改變。 [結(jié)果] 1.選取病理石蠟切片分為腎上腺皮質(zhì)癌組(ACC組)、腎上腺皮質(zhì)腺瘤組(ACA組)及正常腎上腺組織組(NAG組)3組。SP法進(jìn)行免疫組化檢測得出PCAF主要表達(dá)于細(xì)胞核,且ACC組的表達(dá)明顯高于ACA組和NAG組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。qPCR檢測腎上腺皮質(zhì)癌組中PCAF水平約為腎上腺皮質(zhì)腺瘤組的2.15倍。 2.構(gòu)建含PCAF干擾序列的慢病毒載體pLentii6.3-PCAF,建立PCAF下調(diào)的穩(wěn)定細(xì)胞株后,經(jīng)Western blot檢測實驗組較對照組表達(dá)明顯下降(P0.05)。qPCR檢測實驗組PCAF表達(dá)水平為0.332倍。 3.CCK-8檢測細(xì)胞增殖率發(fā)現(xiàn)實驗組增值率較對照組及空白組低(P0.05)。TUNEL原位凋亡法檢測細(xì)胞凋亡率,實驗組凋亡率較對照組及空白組高(P0.05)。劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力,transwell檢測細(xì)胞侵襲能力發(fā)現(xiàn)實驗組遷移、侵襲能力較對照組及空白組低(P0.05),但三組細(xì)胞周期未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的差異。 4.根據(jù)細(xì)胞水平的結(jié)果,選擇western blot檢測相關(guān)蛋白檢測：①Wnt/beta-catenin通路相關(guān)蛋白的檢測,實驗組中變異的beta-catenin蛋白及轉(zhuǎn)移蛋白MMP-7較對照組及空白組降低,而粘附蛋白CD44則出現(xiàn)升高(p0.05)。②線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白的檢測。實驗組的P53、puma、bax、caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白水平較對照組及空白組升高,而抗凋亡蛋白bcl-2則出現(xiàn)下降(p0.05)。③血管通路相關(guān)蛋白的檢測。VEGF-A及HIF-1α在實驗組中的表達(dá)水平較對照組及空白組中低(p0.05)。 5. qPCR檢測上述蛋白mRNA水平,同時也檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)情況。qPCR結(jié)果與Western blot結(jié)果是一致的,細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)在三組間比較未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)差異的結(jié)果。 [結(jié)論] 1. PCAF在腎上腺皮質(zhì)癌中高表達(dá),可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。 2、下調(diào)PCAF基因激活P53/PUMA-BCL-2/caspase-9凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,抑制wnt/β-catenin通路和VEGF/HIF-1通路的激活,可能引起腎上腺皮質(zhì)癌SW-13細(xì)胞在體外生長、遷移和侵襲能力下降。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.11

【參考文獻(xiàn)】

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1 拓航;鄭鑫;涂康生;周振宇;姚英民;劉青光;;PCAF在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2013年03期

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本文編號：1478347