本文關(guān)鍵詞： 缺氧 腎小管上皮細(xì)胞 轉(zhuǎn)錄組 基質(zhì)金屬蛋白酶-2　出處：《東南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度產(chǎn)生和降解減少是腎小管基底膜增厚的根本原因,但內(nèi)在機(jī)制尚未完全研究清楚,如果能掌握細(xì)胞外基質(zhì)代謝相關(guān)基因活動(dòng)全貌將有助于闡明內(nèi)在規(guī)律�；|(zhì)金屬蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase 2, MMP-2)是降解基底膜膠原的關(guān)鍵酶。體外研究發(fā)現(xiàn),缺氧抑制腎小管上皮細(xì)胞MMP-2活性。然而,缺氧為什么引起MMP-2活性下降?調(diào)控機(jī)制至今仍未研究清楚。方法1.缺氧腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析用RNA測(cè)序方法,分別檢測(cè)缺氧和常氧處理的腎小管上皮細(xì)胞整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的變化。2.缺氧狀況下,分別上調(diào)和下調(diào)自噬與內(nèi)吞RAB7、自噬和內(nèi)吞特異性抑制劑、自噬和內(nèi)吞關(guān)鍵蛋白下調(diào)對(duì)MMP-2活性、表達(dá)和活性調(diào)節(jié)蛋白的影響。首先構(gòu)建上調(diào)和下調(diào)RAB7基因載體；再用3-甲基腺嘌呤(3-MA)和菲律平(filipin)分別處理細(xì)胞；接著下調(diào)自噬(Beclin-1)和內(nèi)吞(Caveolin-1)的關(guān)鍵分子。用Zymography法分別測(cè)上清MMP-2活性；qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MMP-2表達(dá)；ELISA方法測(cè)培養(yǎng)上清MMP-2和Ⅳ型膠原蛋白含量；Western blotting檢測(cè)酶活性調(diào)節(jié)蛋白MMP-1、RECK、 TIMP-2表達(dá)。結(jié)果1.缺氧腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析獲得2倍上調(diào)、下調(diào)以及統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水平P0.05的基因共279個(gè)。與腎臟病相關(guān)的上調(diào)基因主要為：細(xì)胞外基質(zhì)與受體相互作用、腎細(xì)胞癌、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等；與腎臟病相關(guān)的下調(diào)基因主要為：抗原處理和遞呈、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白處理、能量產(chǎn)生、谷胱甘肽生成等。此外,還檢測(cè)到缺氧細(xì)胞有51387選擇性剪接、常氧細(xì)胞有49144選擇性剪接和新轉(zhuǎn)錄組9394個(gè)以及單核苷酸多態(tài)性(SNP)69706個(gè)。2.缺氧狀況下,上調(diào)和下調(diào)自噬和內(nèi)吞共享分子RAB7對(duì)MMP-2活性、表達(dá)和活性調(diào)節(jié)蛋白的影響缺氧腎小管上皮細(xì)胞在上調(diào)RAB7基因的表達(dá)后,培養(yǎng)上清中MMP-2活性下降(缺氧+RAB7組：0.10±0.06；缺氧組：0.48±0.07,p0.01)、MMP-2 mRNA表達(dá)水平下降(缺氧+RAB7組：0.81±0.08；缺氧組：1.24±0.16, P0.01)、MMP-2蛋白含量減少(缺氧+RAB7組：2.52±0.26μg/L；缺氧組：3.81±0.13μg/L,P0.01)、Ⅳ型膠原蛋白含量升高(缺氧+RAB7組：5.65±0.20μg/L；缺氧組：5.43±0.17μg/L,P0.05)；下調(diào)RAB7基因的表達(dá),MMP-2活性明顯升高(缺氧+RAB7shRNA組：1.00±0.08；缺氧組：0.48±0.07,P0.01)、MMP-2 mRNA表達(dá)升高(缺氧+RAB7shRNA組：3.80±0.23；缺氧組：1.24±0.16, P0.01)、MMP-2蛋白含量增加(缺氧-1-RAB7 shRNA組：4.31±0.30μg/L；缺氧組：3.81±0.13μg/L, P0.05)、Ⅳ型膠原蛋白含量減少(缺氧·+RAB7shRNA組：5.01±0.20μg/L；缺氧組：5.43±0.17μg/L,P0.01)。缺氧腎小管上皮細(xì)胞上調(diào)RAB7基因的表達(dá),酶活性調(diào)節(jié)蛋白TIMP-2和MMP-14表達(dá)下降；下調(diào)RAB7基因的表達(dá),TIMP-2和MMP-14蛋白表達(dá)升高。與缺氧組相比,無(wú)論上調(diào)還是下調(diào)RAB7基因表達(dá),酶活性調(diào)節(jié)蛋白R(shí)ECK表達(dá)均下降；下調(diào)RAB7表達(dá)之后,RECK表達(dá)下降尤其明顯(P0.01)。3.缺氧狀況下,自噬和內(nèi)吞特異性抑制劑對(duì)MMP-2活性、表達(dá)和活性調(diào)節(jié)蛋白的影響在缺氧條件下抑制自噬,培養(yǎng)上清MMP-2活性有所降低(缺氧+3-MA組：0.25±0.04；缺氧組：0.36±0.07,P0.05)、MMP-2 mRNA表達(dá)水平大幅提升(缺氧+3-MA組：15.53±2.12；缺氧組:1.24±0.16,P0.01)、MMP-2蛋白含量無(wú)顯著變化(缺氧+3-MA組：3.67±0.20μg/L；缺氧組：3.71±0.12μg/L, P0.05)、Ⅳ型膠原蛋白含量略增加(缺氧+3-MA組：5.46±0.06μg/L;缺氧組：5.33±0.14μg/L,P0.05);抑制內(nèi)吞能顯著恢復(fù)MMP-2活性(缺氧+filipin組：0.60±0.08；缺氧組：0.36±0.07, P0.01)、MMP-2 mRNA表達(dá)上調(diào)(缺氧+filipin組：6.40±2.22；缺氧組：1.24±0.16, P0.01)、MMP-2蛋白含量顯著增加(缺氧+filipin組：4.44±0.31μg/L；缺氧組：3.71±0.12μg/L, P0.05)、Ⅳ型膠原蛋白含量有所下降(缺氧+filipin組：5.18±0.02μg/L；缺氧組：5.33±0.14μg/L, P0.05)。在缺氧情況下3-MA、filipin均抑制TMP-2的表達(dá),而3-MA抑制效果更明顯。3-MA和filipin都抑制RECK的表達(dá)。filipin;對(duì)MMP-14的表達(dá)水平有明顯上調(diào)作用。用免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證調(diào)控分子的變化,所得結(jié)果一致。4.缺氧狀況下,自噬和內(nèi)吞關(guān)鍵蛋白下調(diào)對(duì)MMP-2活性、表達(dá)和活性調(diào)節(jié)蛋白的影響缺氧情況下干擾Bec-1基因表達(dá),培養(yǎng)上清MMP-2活性有所降低(缺氧+Bec-1shRNA組：0.35±0.17；缺氧組：0.49±0.02,P0.05)、MMP-2 mRNA表達(dá)水平升高(缺氧+Bec-1shRNA組：2.0±0.03；缺氧組：1.24±0.16, P0.05)、MMP-2蛋白含量無(wú)顯著變化(缺氧Bec-1shRNA組：3.30±0.18μg/L；缺氧組：3.54±0.20μg/L, P0.05)、Ⅳ型膠原蛋白含量亦無(wú)顯著變化(缺氧+Bec-1shRNA組：5.45±0.28μg/L；缺氧組：5.30±0.20μg/L, P0.05);干擾Cav-1基因表達(dá),培養(yǎng)上清MMP-2活性升高(缺氧+Cav-1shRNA組：0.66±0.05；缺氧組：0.49±0.02, P0.01)、MMP-2 mRNA表達(dá)水平顯著升高(缺氧-+Cav-1shRNA組：15.80±3.11；缺氧組：1.24±0.16, P0.01)、MMP-2蛋白含量顯著增加(缺氧+Cav-1shRNA組：4.15±0.26μg/L;缺氧組：3.54±0.20μg/L,P0.01)、Ⅳ型膠原蛋白含量有所減少(缺氧-+Cav-1shRNA組：4.90±0.60μg/L；缺氧組：5.30±0.20μg/L,P0.05)。缺氧狀況下下調(diào)Bec-1基因或Cav-1基因表達(dá),均能抑制TIMP-2的表達(dá),Bec-1shRNA的抑制效果比Cav-1shRNA抑制效果明顯。MMP-14的表達(dá)和TMP-2的表達(dá)情況相似。下調(diào)Beclin-1基因或Cav-1基因表達(dá),均能抑制RECK表達(dá),Bec-1shRNA抑制效果遜于Cav-1shRNA。結(jié)論1.結(jié)果提示,缺氧狀況下,損傷修復(fù)相關(guān)基因活動(dòng)明顯增強(qiáng)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生增加；抗原處理和遞呈相關(guān)基因、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白處理相關(guān)基因、能量產(chǎn)生相關(guān)基因、谷胱甘肽生成相關(guān)基因下調(diào),提示缺氧使細(xì)胞抗損傷能力下降；腎細(xì)胞癌相關(guān)基因上調(diào)提示慢性腎臟病患者腎細(xì)胞癌發(fā)病率升高可能與腎組織缺氧有關(guān)。2.從多角度證明,缺氧腎小管上皮細(xì)胞自噬與內(nèi)吞影響MMP-2的表達(dá)或活性。自噬主要抑制MMP-2mRNA表達(dá)；而內(nèi)吞則主要抑制MMP-2活性。3.缺氧腎小管上皮細(xì)胞Cav-1介導(dǎo)的內(nèi)吞、RECK表達(dá)增加、TIMP-2和MMP-14表達(dá)下降均影響MMP-2活性,其中Cav-1介導(dǎo)的內(nèi)吞可能是MMP-2活性下降的主要原因。4. Cav-1、RAB7可能是干預(yù)慢性腎臟病發(fā)展的潛在靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R692

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