本文關(guān)鍵詞：線粒體損傷對囊腫襯里上皮細胞初級纖毛結(jié)構(gòu)與功能的影響　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究目的：本研究旨在探索常染色體顯性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)中是否存在線粒體損傷,并探討線粒體損傷對初級纖毛結(jié)構(gòu)和功能的影響及其可能機制,以進一步了解纖毛致病假說,并提供干預(yù)多囊腎病的新靶標。實驗方法：1.多囊腎病中線粒體損傷的生物學(xué)驗證(1)采用Western-blot及Real-time PCR方法檢測多囊腎病動物模型pkd1-/-小鼠及正常對照pkd1+/+小鼠腎臟中、人多囊腎囊腫襯里上皮細胞(WT9-12)及正常腎小管上皮細胞(RCTEC)中熱休克蛋白75(Heat shock protein 75, HSP75)、.線粒體內(nèi)膜移位酶44(Translocases of the inner membrane 44, Tim44)、線粒體外膜移位酶20(Translocases of the outer membrane 20, Tim20)、細胞色素C的表達差異。(2)采用透射電鏡觀察WT9-12及RCTEC中線粒體的結(jié)構(gòu)形態(tài)差異。2.多囊腎病中初級纖毛結(jié)構(gòu)及功能異常的生物學(xué)驗證(1)采用Western-blot方法檢測pkdl-/+小鼠及pkdl+/+小鼠腎臟中、WT9-12及RCTEC中驅(qū)動蛋白2(Kinesin 2)、IFT88的蛋白水平表達差異。(2)采用Real-time PCR方法檢測WT9-12及RCTEC中Kinesin 2的表達差異。(3)采用透射電鏡、免疫熒光方法觀察WT9-12及RCTEC中初級纖毛結(jié)構(gòu)差異。3.HSP75對線粒體功能及初級纖毛結(jié)構(gòu)和功能的影響研究(1)采用Western-blot方法檢測WT9-12中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達HSP75后TIM44、TOM20、細胞色素C、Kinesin 2、IFT88的表達差異。(2)采用Western-blot方法檢測RCTEC中siRNA干擾下調(diào)HSP75表達后TIM44、TOM20、細胞色素C、Kinesin 2、IFT88的表達差異。(3)采用化學(xué)發(fā)光法檢測WT9-12中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達HSP75后、RCTEC中siRNA干擾下調(diào)HSP75表達后細胞內(nèi)ATP含量的變化。(4)采用MTT法觀察WT9-12中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達HSP75后、RCTEC中siRNA干擾下調(diào)HSP75表達后細胞增殖的變化。(5)采用激光共聚焦方法觀察WT9-12中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達HSP75后、RCTEC中siRNA干擾下調(diào)HSP75表達后初級纖毛結(jié)構(gòu)的變化。(6)采用流式細胞術(shù)方法檢測WT9-12中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達HSP75后、RCTEC中siRNA干擾下調(diào)HSP75表達后細胞內(nèi)鈣離子濃度變化。結(jié)果：1. Western-blot及Real-time PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)pkd1-/-小鼠腎臟中HSP75、TIM44、TOM20表達較pkdl+／+小鼠減少,細胞色素C表達增多,WT9-12中得到相同結(jié)果。2.透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)與RCTEC比較,WT9-12中線粒體形態(tài)明顯腫脹,線粒體嵴消失。3.免疫熒光發(fā)現(xiàn)與RCTEC比較,WT9-12中初級纖毛數(shù)量變少,長度變短甚至消失。4.WT9-12轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達HSP75后TIM44、TOM20表達上調(diào),細胞色素C表達下調(diào),Kinesin2、IFT88表達上調(diào)。5.RCTEC siRNA干擾下調(diào)HSP75表達后TIM44、TOM20表達下調(diào),細胞色素C表達上調(diào),Kinesin2、IFT88表達下調(diào)。6.化學(xué)發(fā)光法檢測ATP發(fā)現(xiàn)WT9-12轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達HSP75后細胞內(nèi)ATP量明顯減少。RCTEC siRNA干擾下調(diào)HSP75表達后細胞內(nèi)ATP量明顯增加。7.MTT法檢測發(fā)現(xiàn)WT9-12轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達HSP75后促進細胞增殖,RCTEC siRNA干擾下調(diào)HSP75表達后抑制細胞增殖。8.激光共聚焦發(fā)現(xiàn)WT9-12轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達HSP75后初級纖毛長度變長,RCTEC siRNA干擾下調(diào)HSP75表達后初級纖毛長度明顯變短。9.WT9-12轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達HSP75后細胞內(nèi)鈣離子濃度無明顯差異,RCTEC siRNA干擾下調(diào)HSP75表達后72小時細胞內(nèi)鈣離子濃度明顯減低。結(jié)論：本研究結(jié)果表明,多囊腎病模型鼠腎臟及人多囊腎囊腫襯里上皮細胞中存在線粒體損傷,且初級纖毛的結(jié)構(gòu)和纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運功能存在異常,線粒體損傷可能通過能量代謝影響初級纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白功能,并導(dǎo)致初級纖毛長度變短,上調(diào)HSP75表達能夠改善線粒體損傷,促進人囊腫襯里上皮細胞增殖,使初級纖毛長度變長；下調(diào)HSP75表達能夠介導(dǎo)線粒體損傷,抑制正常腎小管上皮細胞增殖,使初級纖毛長度變短、調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流功能異常。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R692.11

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 李曉亮;肖燎原;徐志飛;;膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因蛋白在腫瘤發(fā)生中的作用[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2014年27期

2 肖燎原;盛s，

本文編號：1313860