本文關(guān)鍵詞：TXNIP在UUO小鼠腎間質(zhì)纖維化中的作用

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【摘要】：目的:腎臟間質(zhì)纖維化是各種腎臟病變進展到慢性腎衰竭的共同過程,其主要特征是腎臟內(nèi)固有細(xì)胞纖維化以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的異常堆積。多種分子機制及信號通路參與其進程,包括TGF-β1激活、腎小管上皮細(xì)胞的向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)包括纖維連接蛋白、膠原(I,III,IV,V和VII型)等的堆積,發(fā)揮了重要的作用。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)是一種硫氧還蛋白(thioredoxin,TRX)的內(nèi)源性抑制蛋白,能夠通過與其結(jié)合抑制其功能。有研究顯示,在高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中,敲低TXNIP能夠增加的TRX活性,從而抑制高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,抑制小管細(xì)胞TGF-β信號通路的激活,下調(diào)纖維連接蛋白(fibronectin,FN)的表達。在高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞中,敲低TXNIP能夠抑制高糖誘導(dǎo)的纖連蛋白表達。新近的一項研究顯示,TXNIP與腎臟小管上皮轉(zhuǎn)分化密切相關(guān)。TXNIP在糖尿病腎病腎臟纖維化中發(fā)揮重要作用,其有可能成為治療糖尿病進行性腎纖維化的有效靶點。研究已證實,氧化應(yīng)激損傷在腎臟纖維化中發(fā)揮重要作用。到目前為止,有關(guān)TXNIP在非糖尿病腎臟間質(zhì)纖維化中的作用還未見報道。在本研究中,我們制備了TXNIP基因敲除鼠(TXNIP-/-),采用單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)腎纖維化模型,觀察了TXNIP在UUO小鼠腎臟中的表達情況,以及TXNIP在UUO小鼠腎小管間質(zhì)纖維化中作用,為明確腎臟纖維化的發(fā)病機制及其防治的有效作用靶點提供實驗基礎(chǔ)。方法:1動物模型的建立SPF級C57BL/6(20g-25g)小鼠雄性54只,隨機分為UUO模型組和假手術(shù)對照組(Sham),分別于術(shù)后0 d、3 d、5 d,7 d、14 d取材。觀察TXNIP在不同時間的表達動態(tài)變化情況。TXNIP-/-小鼠行單側(cè)輸尿管結(jié)扎,14 d后處死取材。假手術(shù)(Sham)組開腹游離輸尿管,不結(jié)扎。2腎組織取材和觀察指標(biāo)UUO模型建成后,分別于0 d、3 d、5 d、7 d、14 d各組取6只小鼠;TXNIP基因敲除模型組(TXNIP-/-)只取14 d的標(biāo)本。切取左側(cè)腎臟縱切,一半腎組織用4%多聚甲醛固定,用于光鏡(HE、Masson)常規(guī)病理學(xué)觀察;免疫組織化學(xué)染色檢測α型肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纖連蛋白(fibronectin,FN)、Ⅰ型膠原蛋白(type I collagen,Col I)、IV型膠原蛋白(type IV collagen,Col IV)等在腎組織的表達;另一半腎組織放入液氮凍存,后轉(zhuǎn)入-80℃保存。用于提取腎組織總蛋白以及總RNA。Western blot檢測腎皮質(zhì)TXNIP、α-SMA、TGF-β1、Smad2、p-Smad2、FN、Col I及Col IV的表達。Real-time PCR檢測腎組織TXNIP和α-SMA m RNA的表達情況。結(jié)果:1 TXNIP在UUO模型腎臟不同時間表達情況Western blot和Real-time PCR結(jié)果顯示:TXNIP蛋白及m RNA于UUO模型14d表達明顯增多,而3d、5d以及7d等時間點與對照組相比無明顯變化。2肉眼及病理改變?nèi)庋塾^察Sham對照組小鼠:腎臟大小、形態(tài)均正常,紅褐色,被膜光滑。UUO模型組腎臟明顯增大,色蒼白,薄膜緊張。行腎臟光鏡HE染色、Masson染色顯示:Sham對照組腎臟結(jié)構(gòu),腎小球,腎小管均正常,腎間質(zhì)無明顯炎癥及纖維化改變。UUO模型組腎臟結(jié)構(gòu)破壞明顯,腎小管明顯部分?jǐn)U張,部分萎縮纖維化,腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤明顯,纖維化嚴(yán)重。與UUO組相比,Txnip(-/-)組上述腎臟病理指標(biāo)明顯改善。3細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN,Col I和Col IV蛋白表達情況與Sham對照組相比,UUO組細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN,Col I和Col IV表達水平明顯增高(P均0.01)。與UUO組相比,TXNIP(-/-)組細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN,Col I和Col IV表達水平明顯降低。4α-SMA蛋白及m RNA表達情況與Sham對照組相比,UUO組α-SMA在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)以及間質(zhì)組織表達明顯增高(P0.01)。與UUO組相比,TXNIP(-/-)組α-SMA蛋白表達水平明顯降低。Real-time PCR結(jié)果顯示,α-SMA m RNA在UUO組腎臟表達明顯上調(diào),而TXNIP基因敲除組其表達明顯受抑制。5 TGF-β1表達以及Smad2信號通路激活情況與Sham對照組相比,UUO組TGF-β及p-smad2蛋白表達明顯增高(P0.01)。與UUO組相比,Txnip(-/-)組TGF-β1及p-smad2蛋白表達明顯降低。結(jié)論:1在UUO模型的14天,腎臟TXNIP表達明顯上調(diào)。2敲除TXNIP能夠改善UUO引起的腎小管間質(zhì)纖維化,下調(diào)α-SMA的表達,抑制細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN、ColⅠ以及Col IV的合成。3 TXNIP基因敲除對UUO誘導(dǎo)的腎臟纖維化的保護作用可能部分是通過抑制TGF-β1/Smad 2信號通路實現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R692

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本文編號：1283525