本文關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學(xué)研究熱應(yīng)激引起大鼠附睪頭早期微環(huán)境的變化

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【摘要】：目的建立雄性大鼠生殖系統(tǒng)熱應(yīng)激模型,研究急性熱應(yīng)激對(duì)附睪精子成熟微環(huán)境的影響:利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定附睪熱應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)譜,探討熱應(yīng)激對(duì)于附睪早期微環(huán)境的影響,為附睪精子成熟和男性避孕研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1.將47只大鼠分成三部分:取3只大鼠構(gòu)建大鼠附睪(頭)蛋白表達(dá)譜;取12只大鼠分成4組:正常對(duì)照組、42℃30min組、42℃60min組和42℃120min組,每組3只,做精子活力分析;取32只雄性SD大鼠(300-400g)分成兩組,熱應(yīng)激組和對(duì)照組各16只。通過(guò)將大鼠的睪丸浸泡于42℃水浴中溫浴不同時(shí)間建立熱應(yīng)激模型;對(duì)照組將大鼠于室溫水浴中建立對(duì)照組。2.利用精子分析儀對(duì)精子活力進(jìn)行分析;3.HE染色后光鏡下觀察附睪組織的形態(tài)學(xué)變化。4.蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)上:利用二維凝膠電泳分離熱應(yīng)激和對(duì)照組蛋白,建立蛋白表達(dá)譜,然后再用Image Master 2D Flatinum軟件對(duì)凝膠進(jìn)行掃描并尋找表達(dá)上調(diào)與下調(diào)的蛋白膠點(diǎn),最后取膠點(diǎn)脫色溶出凝膠蛋白,點(diǎn)靶后用通過(guò)5800 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀鑒定表達(dá)蛋白,建立差異附睪頭蛋白表達(dá)譜和熱應(yīng)激相關(guān)差異蛋白表達(dá)譜;綜合利用生物信息學(xué)工具(Gene Ontology,PIR,DAVID)分析差異蛋白分子生物學(xué)功能和參與的分子生物學(xué)過(guò)程。5.分別選取熱應(yīng)激后的上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白中關(guān)鍵的差異蛋白,進(jìn)行免疫組化和蛋白印跡法驗(yàn)證。6.細(xì)胞凋亡法檢測(cè)附睪組織經(jīng)過(guò)熱應(yīng)激后的凋亡情況。結(jié)果1.精子活力分析顯示42℃水浴時(shí)間超過(guò)60min時(shí)大鼠的精子活力開始明顯下降,本研究選擇溫浴60min建立大鼠附睪熱應(yīng)激模型。2.通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)建立了大鼠附睪頭部蛋白表達(dá)譜,鑒定出150個(gè)蛋白;熱應(yīng)激相關(guān)差異蛋白點(diǎn)鑒定出92個(gè),利用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜共鑒定非冗余差異蛋白21個(gè),其中熱應(yīng)激相關(guān)上調(diào)蛋白11個(gè),下調(diào)蛋白10個(gè)。3.HE染色顯示熱應(yīng)激組的附睪組織相對(duì)于對(duì)照組沒(méi)有明顯的形態(tài)學(xué)變化,但熱應(yīng)激組出現(xiàn)附睪上皮組織細(xì)胞核空泡化。4.免疫組織化學(xué)和蛋白印跡法證實(shí)了Prdx6和Clu在熱應(yīng)激組表達(dá)顯著下降,SOD1在熱應(yīng)激組表達(dá)增高的差異表達(dá)趨勢(shì)。5.細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激組細(xì)胞凋亡明顯增加。結(jié)論構(gòu)建了大鼠附睪急性熱應(yīng)激模型,通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定了熱應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)譜,并驗(yàn)證了熱應(yīng)激對(duì)附睪蛋白表達(dá)的影響以及引起附睪微環(huán)境的變化,為附睪生理功能和精子成熟研究提供了有用的信息。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R697
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本文編號(hào)：1136657