本文關鍵詞：單側輸尿管梗阻大鼠間質纖維化腎臟組織和血漿中microRNA-21的表達及意義

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【摘要】：背景：腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis, RIF)是包括移植腎相關疾病在內的各種腎臟病發(fā)展為終末期腎衰竭的共同病理路徑。慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)的病因主要包括原發(fā)性腎小球腎炎、高血壓腎病、繼發(fā)性腎小球腎炎、糖尿病腎病、腎小管間質病變、遺傳性腎病等,在發(fā)達國家,糖尿病腎病和高血壓腎病已成為CKD的主要原因,而在我國,上述兩種疾病在各種病因中仍處于原發(fā)性腎小球腎炎之后,但近年也有明顯增加趨勢。近10余年以來,國際范圍CKD的流行病學研究廣受關注,在美國等發(fā)達國家的全國性調查顯示,CKD是常見的慢性疾病,CKD在成年人群中患病率為10.2%-13.0%。在中國由王海燕教授牽頭的“中國慢性腎臟病流行病學調查”采用多階段分層抽樣設計,獲得能夠代表中國成年人群的調查對象共計47204人,評價調查結果顯示,中國18歲以上人群中CKD患病率為10.8%,據此估算,我國目前有CKD患者將達到1.2億例。根據發(fā)達國家的統(tǒng)計數據,CKD患者中約有2%患者會進入終末期腎衰竭階段,需要接受腎移植或者透析治療來維持生命；按照每例尿毒癥患者透析治療花費10萬元人民幣/年計算,每年中國將為這些患者的透析支付2400億元人民幣。此外,CKD也與其他常見的慢性疾病之間存在復雜的交互作用,例如一項針對100萬余人的隨訪研究結果表明,與腎功能正常者相比,腎功能輕中度下降者心血管病事件增加40%,死亡率增加20%,并且隨著腎功能下降風險呈線性增加趨勢。所以慢性腎臟病在中國已經成為最為嚴重的公共衛(wèi)生問題之一。隨著醫(yī)學技術的發(fā)展,人體器官移植技術成為20世紀醫(yī)學領域取得的重大進展之一,腎移植技術已成為目前治療終末期腎病的最理想替代治療方法,雖然移植腎的近期存活率已明顯提高,但是晚期存活率并未相應升高,遠期移植腎衰竭的最主要原因就是慢性移植腎腎病(chronic allograft nephropathy, CAN),常出現(xiàn)在移植后數月至數年,CAN的主要病理學變化包括腎間質纖維化和腎小管萎縮、腎小球硬化,在以上病理學改變中,腎小管萎縮和腎間質纖維化是影響移植腎遠期預后的最關鍵因素。在移植腎病理診斷中,Banff2005已經刪除了CAN這一概念,取而代之的是間質纖維化和腎小管萎縮(interstitial fibrosis and tubular atrophy, IF/TA),并且引入了兩個新的病理類型；慢性T細胞介導的排斥(chronic T-cell mediated rejection, CTMR)和慢性抗體介導的排斥(chronic antibody-mediated rejection, CAMR)。目前國內外對腎間質纖維化的發(fā)生發(fā)展做出了深入研究,尤其在腎間質纖維化的信號通路研究方面取得了矚目的科研成果。大量研究證明轉化生長因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)/Smad信號通路在器官纖維化的發(fā)展過程中起著主要作用,且有報告指出TGF-β1/Smad信號通路可能通過調控下游多種microRNA,從而控制上皮間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)以及纖維化,從而影響各種器官纖維化的發(fā)展過程。MicroRNAs(miRNAs)是一類廣泛存在于動植物基因組中的功能性非編碼小分子RNA,大多由21至23個核苷酸構成,可通過與靶基因mRNA特定位點結合,誘導該mRNA降解或該蛋白合成而參與各種基因的表達和調控。在目前醫(yī)療技術水平階段,慢性腎臟病以及腎移植后出現(xiàn)血肌酐升高、蛋白尿等表現(xiàn)時,組織穿刺活檢仍是病因診斷的金標準,但是不論是原位腎臟穿刺還是移植腎穿刺,都要面臨出血、感染等風險,目前國內關于]miRNA-21在腎臟纖維化機制中的作用報道較少,本實驗通過測定miRNA-21在單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstructive, UUO)大鼠間質纖維化腎臟組織和血漿中的表達,初步探討其在TGF-β1/Smad3信號通路中的機制及意義,進而為尋找無創(chuàng)性檢測腎間質纖維化特異性生物標記物提供一定理論依據。目的：(1)檢測MicroRNA-21 (miRNA-21)在正常大鼠腎臟組織和血漿中的表達,并檢測其在UUO大鼠間質纖維化腎臟組織和血漿中的表達,觀察分析miRNA-21在兩組中的表達差異。(2)初步探討miRNA-21在TGF-β1/Smad3致大鼠腎間質纖維化信號通路中的機制。方法：(1)建立UUO大鼠模型：選擇20只SD雄性大鼠,隨機分為輸尿管梗阻模型組(UUO組參和假手術組(Sham組),UUO組大鼠結扎左側輸尿管,Sham組只分離左側輸尿管而不結扎,別于建模后第3天、第7天各采集兩組5只大鼠血液及腎臟組織進行相關檢測。(2) miRNA-21檢測應用實時熒光定量PCR (real-time qPCR)方法檢測腎臟組織及血漿中miRNA-21的表達變化：UUO組和Sham組大鼠第3天及第7天腎臟組織RNA抽提按照Trizol試劑說明書進行,并使用紫外吸收對抽提出的RNA進行純度和濃度檢測,使用抽提出的腎臟組織RNA進行cDNA合成, 配備RT反應液后在PCR擴增儀進行RT反應,各樣品的目的miRNA和內參(U6)分別進行Real-time qPCR反應,數據采用2-△△CT法進行分析,Sham組2-△△CT為1作為基準校正。血漿nicroRNA-21檢測：使用TRI Reagent BD抽提血漿RNA,其余檢測方法同上。(3)腎臟組織病理觀察腎臟組織常規(guī)進行包埋及切片,采用HE、masson染色和免疫組化技術評價腎組織間質纖維化程度,使用免疫組化檢測腎臟組織中TGF-β1、Smad3、I型膠原蛋白(collagen Ⅰ, Col-Ⅰ)和α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)蛋白表達情況。(4)統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析,組間計量資料數據以x±s表示,采用單因素方差分析,方差齊性組間比較采用LSD-t檢驗,若方差不齊采用Dunnett's T3法,相關性分析采用Spearman法,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果：(1)兩組大鼠microRNA-21表達的變化建模后第3天和第7天UUO組腎臟組織和血漿中miRNA-21與Sham比較均升高(P均=0.000),7天UUO腎組織和血漿中miRNA-21與3天UUO相比升高(P=0.008和P=0.024),但血漿中miRNA-21表達水平不如腎臟組織明顯。(2)兩組大鼠腎臟組織病理學觀察觀察HE染色切片,Sham組腎單位大小、形態(tài)均未見異常,UUO組建模后3天見腎小管輕度擴張、小管上皮空泡樣變,間質輕度水腫并散在炎性細胞,建模后7天即可觀察到明顯的腎間質增寬、膠原沉積增加、腎小管萎縮等,炎癥細胞浸潤明顯,證明建模成功。觀察masson染色大鼠腎臟組織,Sham組第3天和第7天masson染色無變化,腎單位及間質未見異常。UUO組建模后第3天,可見腎小管管腔輕度擴張,部分間質可見少量淡藍色膠原組織沉積,UUO組建模后第7天,腎小管較3天模型組明顯擴張,間質水腫增寬明顯伴單核細胞及淋巴細胞廣泛浸潤,間質膠原纖維進行性增多、面積擴大、藍染加重。3天UUO組、7天UUO組、3天Sham組和7天Sham組的masson染色膠原陽性面積評分組間比較有統(tǒng)計學差異(F=194.228,P=0.000),UUO組3天和7天腎臟組織纖維化程度評分明顯高于同時期Sham組(P=0.000和P=0.000), UUO組7天纖維化面積與3天相比顯著增多(P=0.000)。Sham組大鼠3天及7天腎臟組織中TGF-β1僅在腎小管上皮細胞中少量表達,間質中無表達,且各時間點無明顯變化。與Sham組相比,UUO組3天、7天TGF-β1在腎小管上皮細胞和組織間質表達面積隨時間逐漸增多,陽性染色逐漸加深。3天UUO組、7天UUO組、3天Sham組和7天Sham組的腎臟組織TGF-β1陽性面積組間存在顯著差異(F=423.844,P=0.000),UUO組TGF-β1|陽性面積與同時期：Sham組比較統(tǒng)計學差異顯著(P=0.000和P=0.000),UU07天TGF-β1陽性面積較UU03天組增多(P=0.000)。Sham組大鼠3天及7天腎臟組織中Smad3蛋白表達無明顯變化,表達于少部分‘腎小管上皮細胞中。UUO組3天、7天Smad3與Sham組相比,在腎小管上皮細胞、組織間質表達面積明顯增多,且強陽性表達于UUO組7天組織。3天UUO組、7天UUO組、3天Sham組和7天Sham組的腎臟組織Smad3陽性面積組間存在顯著差異(F=768.544,P=0.000),兩兩比較UUO組Smad3陽性面積明顯多于同時期Sham組(P=0.000和P=0.000),UU07天Smad3陽性面積多于UU03天(P=0.000)Sham組Col-Ⅰ在腎小管間質少量表達,與同時間Sham組比較,UUO組大鼠腎臟組織Col-Ⅰ蛋白表達面積明顯增多,建模后時間越長,陽性面積表達越多。組間Col-Ⅰ表達面積具有明顯統(tǒng)計學差異(F=1108.079,P=0.000),各組間兩兩比較,UUO組Col-Ⅰ陽性面積多于同時期Sham組(P=0.000),UU07天Col-Ⅰ陽性面積多于UU03天(P=0.000)。α-SMA在Sham組陽性面積較少,UUO組α-SMA在腎組織間質中表達面積隨建模后時間延長增多,7天陽性染色最深。組間α-SMA表達面積具有明顯統(tǒng)計學差異(F=292.363,P=0.000),各組間兩兩比較,UUO組α-SMA陽性面積多于同時期Sham組(P=0.000),UU07天α-SMA陽性面積明顯較UU03天增多(P=0.000)。(3) MicroRNA-21與組織纖維化相關性分析UUO組腎組織和血漿中miRNA-21的表達與腎間質纖維化評分正相關(r=0.816、r=0.907,P均=0.000)；腎組織miRNA-21與TGF-β1、Smad3、Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表達呈正相關(r=0.79、r=0.849、r=0.888、r=0.882, P均=0.000)；血漿miRNA-21與TGF-β1、Smad3、Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表達呈正相關(r=0.816、r=0.875、r=0.904、r=0.905, P均=0.000)。結論：(1)UUO大鼠腎組織和血漿中microRNA-21在建模后表達上調,且間質纖維化程度越重表達越高。(2) TGF-β1/Smad3信號通路可能是促進下游,microRNA-21表達上調,從而介導大鼠腎間質纖維化。
【關鍵詞】：microRNA-21 纖維化 單側輸尿管梗阻 轉化生長因子-β1/Smad3
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R692
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-23
• 第一章 單側輸尿管梗阻大鼠間質纖維化腎臟組織和血漿中microRNA-21的表達23-41
• 1.1 研究的目的和意義23
• 1.2 材料和方法23-35
• 1.3 結果35-38
• 1.4 討論38-41
• 第二章 MicroRNA-21在TGF-β1/Smad3致大鼠腎間質纖維化信號通路中的機制初步研究41-57
• 2.1 研究的目的和意義41
• 2.2 材料和方法41-48
• 2.3 結果48-54
• 2.4 討論54-57
• 參考文獻57-61
• 文獻綜述61-71
• 參考文獻66-71
• 中英文對照與縮略詞表71-72
• 學習期間發(fā)表論文72-73
• 致謝73-75

【共引文獻】

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本文編號：1117065