本文關(guān)鍵詞：MPPa-PDT介導乳腺癌細胞周期阻滯與聯(lián)合HSV1-TK治療前列腺癌的研究探討

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【摘要】：第一部分MPPa-PDT介導乳腺癌細胞周期阻滯的研究乳腺癌是女性常見的十大惡性腫瘤之一。近年來,我國乳腺癌的發(fā)病率在逐年增長,而且年輕患者所占的比例也在增加。但是,乳腺癌的發(fā)病原因還沒能夠被徹底的研究清楚。對于高發(fā)病年齡段的人群,我們也還沒有發(fā)現(xiàn)可以有效預防乳腺癌發(fā)生的有效措施。對于已確診的乳腺癌患者,在其治療過程中也尚未能理想地控制其復發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此,高質(zhì)量的科學研究結(jié)果對于乳腺癌患者的治療具有至關(guān)重要的作用。光動力治療是在上世紀七十年代產(chǎn)生的一種腫瘤治療技術(shù),它以光敏劑來介導治療,惡性組織會選擇性地吸收光敏劑。用特定波長的光激發(fā)光敏劑,光敏劑被激發(fā)后獲得能量,被激發(fā)的光敏劑可把獲得的能量傳遞給周圍的氧分子,通過一系列能量轉(zhuǎn)換過程,最終產(chǎn)生大量的具有極高反應活性的活性氧族,從而導致細胞死亡。光敏劑作用于靶組織的方式有多種,可以將光敏劑直接涂抹在腫瘤表面,也可通過局部注射使光敏劑進入腫瘤組織內(nèi),或者是通過靜脈注射的方式使光敏劑先進入血液循環(huán),由于腫瘤組織可以選擇性吸收光敏劑而使得光敏劑濃集于腫瘤組織內(nèi)。目前,大多數(shù)光動力治療中所使用的光敏劑都有一個類似于葉綠素或血紅蛋白雜環(huán)結(jié)構(gòu)。焦脫鎂葉綠酸-a甲酯(Methyl pyropheophorbide-a, MPPa)是一種有效的新型光敏劑,它是葉綠素的衍生物。細胞對外部刺激的反應多種多樣,包括細胞增殖、分化、死亡以及細胞調(diào)節(jié)等。雖然細胞的增殖和死亡是細胞對外界刺激的兩種截然不同的反應,但是在這兩種不同的生物反應過程中也有一些相似的形態(tài)學和生物化學改變。細胞周期調(diào)控是決定細胞是發(fā)生增殖還是凋亡的雙向開關(guān)。不同的物理和化學刺激可以引起不同的細胞損傷,并且細胞修復受損的能力在不同時期也是不一樣的。研究表明,凋亡可以發(fā)生在細胞周期阻滯的不同階段。細胞凋亡和細胞周期控制機制之間存在一定的聯(lián)系。細胞周期檢測點可以確保在細胞周期不同時期DNA復制和染色體分布的質(zhì)量�？刂萍毎芷跈z測點可以導致細胞凋亡的發(fā)生。[實驗目的]通過檢測經(jīng)過光動力治療后MDA-MB-231細胞發(fā)生的細胞周期阻滯以及細胞周期相關(guān)蛋白CHK2、P21、CyclinDl的變化,以進一步了解MPPa-PDT作用于乳腺癌細胞系MDA-MB-231的作用機制。[實驗方法]1.將MDA-MB-231細胞分成四組,除對照組外,對其余三組進行相同MPPa濃度,不同照光劑量的處理。2.流式細胞儀檢測細胞周期阻滯。3. Western blot檢測細胞內(nèi)細胞周期相關(guān)蛋白CHK2, P21, CyclinDl的表達水平變化情況。[實驗結(jié)果]1.流式細胞儀檢測結(jié)果表明,光動力治療后的細胞凋亡率約為46%；與對照組相比,S期的細胞數(shù)目明顯增加。2. Western blot檢測結(jié)果：經(jīng)過光動力治療后細胞內(nèi)細胞周期蛋白D1的表達量下降顯著,而CHK2和P21的表達量明顯增加。[結(jié)論]1. MPPa介導的光動力治療所誘導細胞周期阻滯發(fā)生在S期。2.光動力療法可以抑制MDA-MB-231細胞的增殖。3. MPPa介導的光動力治療可通過正向調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D1的表達和負向調(diào)節(jié)Chk2和P21的表達來誘導細胞凋亡。第二部分MPPa-PDT聯(lián)合HSV1-TK治療前列腺癌的研究腫瘤的自殺基因治療(也即藥物敏感基因治療),指的是將某些細菌或者病毒的基因?qū)肽[瘤細胞內(nèi),自殺基因編碼的酶類物質(zhì)可將藥物轉(zhuǎn)化成毒性物質(zhì),后者可殺滅腫瘤細胞。更昔洛韋(Ganciclovir, GCV),是鳥嘌呤核苷酸的衍生物。GCV在HSV1-TK作用下發(fā)生磷酸化,轉(zhuǎn)變成單磷酸鹽,再經(jīng)細胞激酶(內(nèi)源性)的作用,可轉(zhuǎn)化為二磷酸鹽和三磷酸鹽,GCV的二磷酸鹽和三磷酸鹽對處于增殖過程中的哺乳動物細胞有很強的毒性作用。糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose-regulated protein 78, GRP78)在乳腺癌、腦部腫瘤、胃癌、前列腺癌等多種腫瘤組織中表達水平明顯增高。GRP78可以激活HSV1-TK的表達,以消除腫瘤細胞。焦脫鎂葉綠酸-a甲酯是葉綠素的衍生物,這種新型光敏劑易于在前列腺癌PC-3細胞中富集并可以通過光動力作用殺傷癌細胞,而對正常細胞基本無殺傷作用。[實驗目的]將MPPa-PDT光動力治療與HSV1-TK基因療法聯(lián)合應用,PC-3中活躍的GRP78啟動子可以啟動轉(zhuǎn)染入PC-3的自殺基因HSV1-TK大量表達,因而將藥物前體更昔洛韋轉(zhuǎn)化為磷酸鹽的形式,GCV磷酸鹽對腫瘤細胞DNA的合成產(chǎn)生抑制作用從而殺傷腫瘤細胞。該治療同時聯(lián)合MPPa-PDT,以明確兩種治療方法聯(lián)用可以增加治療效果。[實驗方法]1.在Gen-Bank中檢索HSV1-TK 的mRNA,設計上下游引物,進行PCR擴增,以獲取目的基因。2.構(gòu)建HSV1-TK表達載體GV230-TK,然后取部分重組質(zhì)粒測序鑒定一下質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。3.將重組質(zhì)粒通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞株P(guān)C-3。質(zhì)粒GV230-TK含有綠色熒光蛋白基因,轉(zhuǎn)染腫瘤細胞后在熒光顯微鏡下可觀察到有明亮的綠色熒光,以直觀明確轉(zhuǎn)染效率。收集細胞蛋白進行Western Blot檢測來明確HSV1-TK基因是否成功轉(zhuǎn)染并表達。4.將待處理細胞分為四組：HSV1-TK/GCV+MPPa-PDT聯(lián)合治療組,單純MPPa-PDT治療組,單純HSV1-TK/GCV治療組及對照組。5.CCK-8實驗來測定四個組細胞的存活率狀況。6.用流式細胞儀檢測分析各組細胞的凋亡情況。[實驗結(jié)果]1.CCK-8實驗結(jié)果顯示,單純HSV1-TK/GCV治療組相比對照組細胞存活率降低,單純MPPa-PDT治療組相比對照組細胞存活率下降,HSV1-TK/GCV+MPPa-PDT聯(lián)合治療組均比其它三組細胞存活率下降更加明顯。聯(lián)合治療組比其它組細胞存活率明顯降低。2.流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,實驗組均出現(xiàn)明顯細胞凋亡,聯(lián)合治療組比其它組凋亡更加明顯。[結(jié)論]HSV1-TK/GCV治療同時聯(lián)合MPPa-PDT治療可以增進單純MPPa-PDT治療和單純HSV1-TK/GCV治療的促凋亡效果,其機制可能與促凋亡而產(chǎn)生增殖抑制作用有關(guān)。HSV1-TK基因治療同時聯(lián)合MPPa-PDT可以增進前列腺癌的治療效果。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌 焦脫鎂葉綠酸-A甲酯 細胞周期 光動力治療 凋亡 更昔洛韋 光動力療法 前列腺癌
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-16
• 符號說明16-18
• 第一部分 MPPa-PDT介導乳腺癌細胞周期阻滯的研究18-36
• 前言18-21
• 材料21-23
• 方法23-28
• 結(jié)果28-29
• 討論29-31
• 附圖31-33
• 參考文獻33-36
• 第二部分 MPPa-PDT聯(lián)合HSV1-TK治療前列腺癌的研究36-55
• 前言36-38
• 材料38-39
• 方法39-44
• 結(jié)果44-45
• 討論45-48
• 附圖48-52
• 參考文獻52-55
• 致謝55-56
• 碩士在讀期間發(fā)表的論文目錄56-57
• 學位論文評閱及答辯情況表57

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