發(fā)布時間：2017-10-17 07:37

  本文關(guān)鍵詞：細胞分裂調(diào)節(jié)蛋白1（PRC1）的表達對前列腺癌臨床進展及預后的預測意義

  更多相關(guān)文章： 前列腺癌 PRC1 臨床病理特征 生化復發(fā) 預后

【摘要】：研究背景和目的：作為歐美等西方國家最為常見的惡性腫瘤之一,前列腺癌的致死率在男性腫瘤中高居第二位,每年在全世界范圍內(nèi)有超過90萬人被診斷為新發(fā)的前列腺癌。在2015年,美國前列腺癌新發(fā)病例數(shù)達到220800例,占男性惡性腫瘤新發(fā)病例數(shù)的26%,高居第一位,死亡病例數(shù)為27540例,占男性惡性腫瘤死亡人數(shù)的9%,是美國男性惡性腫瘤第二大死因。相對于歐美等發(fā)達國家來說,中國前列腺癌發(fā)病率較低,但近年來隨著生活條件的改善、飲食結(jié)構(gòu)的改變、人口的老齡化進程的加快,我國前列腺癌發(fā)病率、死亡率均有明顯提升,據(jù)相關(guān)統(tǒng)計,上海1997-1999年前列腺癌的發(fā)病率較1985-1987年增加了3.5倍。隨著診斷和治療技術(shù)的發(fā)展,大部分前列腺癌患者在早期就接受了根治手術(shù)或者去勢治療,治療延長了生命,但是在這些患者中,術(shù)后約有20%-50%出現(xiàn)了生化復發(fā)(BCR Biochemical recurrence),而補救性治療(放療、化療、冷凍、消融)的效果均不理想。在現(xiàn)今的前列腺癌預后相關(guān)指標的研究方面,PSA、Gleason、 TMN分期、激素受體、切緣陽性等指標已經(jīng)被用于預測術(shù)后前列腺癌的生物學行為。上述指標提高了人們對前列腺癌根預后的預見性,可惜這些指標無論是單獨還是聯(lián)合都不能準確地診斷復發(fā)及轉(zhuǎn)移。所以在腫瘤分子生物學領(lǐng)域?qū)ふ腋唷⒏禺惖�、有助于預測前列腺癌預后的病理或生化指標就顯得尤為迫切了。在前列腺癌分子生物學研究領(lǐng)域尤其是基因組學領(lǐng)域中,近年來經(jīng)過多位學者的努力,一批與前列腺癌發(fā)生發(fā)展密切的基因逐漸涌現(xiàn)出來,其中多個與細胞周期(Cell cycle progression, CCP)相關(guān)的基因被證實與前列腺癌術(shù)后的預后相關(guān),而且其中31個CCP基因已經(jīng)被挑選出來構(gòu)建成CCP評分模型并用于預測根治術(shù)后前列腺癌細胞的生物學行為,這個模型的有效性已經(jīng)得到證實。細胞質(zhì)分裂調(diào)控蛋白1(Protein regulator of cytokinesis 1 PRC1)是31個CCP基因之一,該基因主要在G2/M期表達,但是當細胞進入G1期或退出有絲分裂后PRC1蛋白表達明顯就會下降。既往研究表明PRC1直接受抑癌基因P53的負性調(diào)控,而且在乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌等腫瘤的研究中PRC1都被作為惡性增殖標志和治療的靶標,但是PRC1與前列腺癌預后的研究尚無報道。在本研究中,我們首先通過復習文獻了解PRC1在腫瘤進展過程中的角色,隨后在前列腺癌細胞株中用QPCR及Western blot的方法證明PRC1在mRNA及蛋白水平表達上調(diào)。接下來在前列腺癌組織芯片中利用免疫組化的方法分析癌組織和非癌組織中PRC1的表達的差異,進一步在基因芯片數(shù)據(jù)庫—Taylor數(shù)據(jù)庫(NCBI GEO accession:GSE21032)中分析mRNA水平該基因在癌組織和非癌組織的表達情況,綜合分析了RC1與前列腺癌病理特征之間的相關(guān)性。最終聯(lián)合目前常用的臨床指標如PSA、Gleason評分等構(gòu)建前列腺癌的預測模型,在統(tǒng)計學上說明了PRC1與前列腺癌進展、預后尤其是生化復發(fā)的相關(guān)性。實驗材料為了挑選與前列腺癌進展密切相關(guān)的基因,我們在Taylor數(shù)據(jù)庫(NCBI GEO accession no:GSE21032;該數(shù)據(jù)庫包括179例臨床樣本和細胞株相應的microRNA及mRNA的表達譜芯片數(shù)據(jù))對31個與前列腺癌根治術(shù)后預后密切相關(guān)的CCP基因進行篩選,進一步分析相關(guān)文獻挑選出本研究的目的基因PRC1。同時整理了Taylor數(shù)據(jù)庫中前列腺原位癌(150例)和前列腺癌旁組織(29例)的臨床病理、術(shù)后隨訪等信息,用于統(tǒng)計分析。本研究使用的細胞株(PC3、Lncap、BPH-1)購自美國ATCC。細胞株mRNA提取試劑(Invitrogen,Madison,USA)、PRC1基因逆轉(zhuǎn)錄試劑購自(TakaraBiotechnology),蛋白提取試劑、Western blot實驗試劑購自于sigamao免疫組織化學分析使用的組織芯片購自于上海(Shanghai Outdo Biotech Co,LTD(Cat No:HPro-Adel 80PG-01))該芯片包含99例前列腺原位癌組織及81例前列腺癌旁組織,每一例標本都附帶該患者相應的臨床信息,且所有患者術(shù)前均沒有接受過化療及放療。實驗方法：1.細胞培養(yǎng)：前列腺癌細胞株P(guān)C3及LNCAP、前列腺增生細胞BPH都購自ATCC,細胞在含有10%胎牛血清和1%的雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)箱調(diào)節(jié)至37℃,5%的二氧化碳。2. 實時定量PCR (QPCR):按照試劑盒步驟從前列腺增生細胞和前列腺癌細胞中提取總RNA,取2ug總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄,采用20ul體系進行實時熒光定量,QPCR使用RotorGene 2000 system(Corbett Research,Mortlake,Australia)進行,數(shù)據(jù)分析使用Rotor-Gene v5.0(Corbett Research),操作方法參照儀器所附帶的實驗方案。3. Western blot:從前列腺增生細胞和前列腺癌細胞中提取蛋白,取2ug蛋白在SDSPAGE膠電泳并轉(zhuǎn)移至雜交硝酸纖維素膜上,用5%脫脂奶粉溶于TBST封閉1小時,隨后將膜洗干凈,按照1：2000的比例稀釋PRC1抗體(rabbit monoclonal antibody,ab51248,Abcam Co Ltd.,USA)及β-actin抗體(sc-47778,Santa Cruz,USA),整夜孵育,使用SuperSignal West PICO的化學發(fā)光檢測系統(tǒng)觀察結(jié)果,選擇β-actin作為內(nèi)參蛋白。4. 免疫組化分析：10%中性福爾馬林保存臨床樣本后進行石蠟包埋,組織被切成厚度為4um的切片,隨后二甲苯脫去石蠟、水化(DAKO EnVision System (Dako Diagnostics, Switzerland).蛋白酶消化并阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,按1：200的比例稀釋一抗體((rabbit monoclonal antibody, ab51248, Abcam Co Ltd., USA),4℃冰箱中整夜孵育一抗。第二日洗凈切片,使用辣根過氧化物標記的多聚物進行標記、色原體基質(zhì)處理發(fā)現(xiàn)目標蛋白的染色情況,實驗中空白對照不加一抗處理。在蘇木素復染后,由兩位病理醫(yī)生獨立地對組織的免疫染色情況進行評分,這兩位醫(yī)師不知道患者的診斷及預后。隨后對兩組評分數(shù)據(jù)進行比較,任何標本的評分出現(xiàn)差異都要重新評估,直到兩位病理醫(yī)師的評分達到一致時,免疫染色評分才算完成。具體評分方法如下：(在顯微鏡下取十個典型的視野并數(shù)出陽性染色細胞數(shù),計算出陽性細胞比例,根據(jù)抗體說明書,細胞質(zhì)染色即為陽性。根據(jù)染色細胞的比例(0-100%)及染色的深度(0-陰性、1-弱陽性、2-中等陽性、3-強陽性來評定每一個腫瘤組織切片目的蛋白表達水平。染色細胞比例評分及染色深度評分相加構(gòu)成了最終的免疫組化評分(immunoreactivity score, IRS) 。5.統(tǒng)計學處理：所有實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示,數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包(SPSS Inc,IL,USA)處理。獨立樣本T檢驗結(jié)果用表示,所有2×2表格進行Fisher精確檢驗,對非2×2進行Pearson卡方檢驗,使用Kaplan-Meier方法和Log-rank檢驗進行生存分析,Cox危險因素回歸模型用于分析單因素和多因素的生存分析,當P值小于0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果：a. 從CCP基因群中挑選出PRCl我們在Taylor數(shù)據(jù)庫中用Kaplan-Meier plots分析了這31個CCP基因與前列腺癌生存率以及生化復發(fā)率的關(guān)系,結(jié)果顯示其中10個表達上調(diào)的基因和生化復發(fā)相關(guān)。在這個列表包含的基因中,既往研究表明PRC1可能是為惡性腫瘤細胞增殖的指標。同時多項研究也報道了該基因與人類多種癌癥的不良預后密切相關(guān),故選擇PRC1作為目的基因進行研究。b.PRC1在前列腺癌細胞株表達上調(diào)。QPCR及Westernblot在mRNA水平、蛋白水平證實：與前列腺良性增生細胞(BPH-1)相比,前列腺癌細胞中PRC1基因在mRNA、蛋白水平都呈現(xiàn)出表達上調(diào)(P0.05)。c.PRC1蛋白在前列腺癌臨床標本中表達上調(diào)前列腺癌組織芯片的免疫組化結(jié)果提示PRC1蛋白主要表達部位在癌組織的胞質(zhì),在癌旁組織不表達或只是中等表達,并且PRC1蛋白在前列腺癌組織中的表達量明顯高于非癌組織。(免疫組化評分(IRS)：IRS:PCa=5.56±1.624vs.Benign=4.65±1.352,P0.001d. PRC1的mRNA表達量與前列腺癌臨床病理特征相關(guān)臨床芯片免疫組化證實PRC1蛋白表達上調(diào),而在Taylor基因芯片中,PRC1在前列腺癌組織中的mRNA表達量也明顯高于非癌組織(PCa=6.8734±0.3802 vs. Benign=6.6129±0.1239, P0.001)。更有意義的是,PRC1的表達量增加與高Gleason評分(P=0.041),腫瘤轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)(P0.006),生化復發(fā)(P0.013)都密切相關(guān),這些信息都表明PRC1和前列腺癌的臨床預后存在緊密的聯(lián)系。e.分析PRC1的mRNA表達量有助于預測前列腺癌的預后我們使用Kaplan-Meier在Taylor數(shù)據(jù)庫中分析了PRC1基因表達量與前列腺癌患者總體生存率、生化復發(fā)率之間的聯(lián)系。以PRC1表達量的中位數(shù)為分割點將前列腺癌組織分為高表達組(75例)和低表達組(75例)。對于預測前列腺癌總體生存率,PRC1高表達組和低表達組之間沒有統(tǒng)計學差異,但在生化復發(fā)的研究中,高表達組明顯更早地出現(xiàn)了生化復發(fā)。在COX回歸分析中,單因素分析中高表達組與低表達組在生化復發(fā)時間上也表現(xiàn)出明顯差異(HR 5.08, 95% CI 2.51-10.26; P0.001)=此外,在多因素分析結(jié)果中,表達上調(diào)的PRC1 (HR 6.23,95% CI 2.08-19.06; P=0.001)、高Gleason評分(HR 2.70,95% CI 1.69-4.33; P＜0.001、術(shù)前高PSA水平(HR 1.01,95% CI 1.00-1.01; P=0.02)都是生化復發(fā)獨立的預測因子。結(jié)論：1.PRC1在前列腺癌細胞及癌組織中表達均上調(diào),其在mRNA及蛋白質(zhì)水平的上調(diào)表達有助于鑒別前列腺癌及前列腺良性組織。2.PRC1的表達上調(diào)與前列腺癌的多項病理特征相關(guān),臨床檢測PRC1的表達量可以有協(xié)助預測前列腺癌的預后。3.前列腺癌患者PRC1的表達與前列腺癌根治術(shù)后生化復發(fā)相關(guān),評估PRC1的表達有助于預測前列腺癌術(shù)后生化復發(fā),可以協(xié)助臨床醫(yī)生制定個性化的治療方案。
【關(guān)鍵詞】：前列腺癌 PRC1 臨床病理特征 生化復發(fā) 預后
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 第一章 前言17-40
• 1.1 前列腺的解剖結(jié)構(gòu)17-18
• 1.2 前列腺癌的流行病學概述18-21
• 1.3 前列腺癌分子生物學研究概述21-23
• 1.4 前列腺癌進展相關(guān)分子生物學變化23-24
• 1.5 前列腺癌診斷24-29
• 1.6 前列腺癌治療29-31
• 1.7 前列腺癌生化復發(fā)(BIOCHEMICAL RECURRENCE)31-33
• 1.8 細胞周期進展基因與腫瘤預后(CELL CYCLE PROGRESSION SCORE)33-36
• 1.9 PRC1基因概述36-38
• 1.10 本研究擬解決的問題38-40
• 第二章 實驗材料與方法40-56
• 2.1 實驗材料40-44
• 2.2 實驗主要試劑44
• 2.3 實驗主要溶液配制44-46
• 2.4 實驗儀器46-47
• 2.5 實驗方法47-54
• 2.6 前列腺癌基因芯片數(shù)據(jù)庫(TAYLOR數(shù)據(jù)庫)54-55
• 2.7 統(tǒng)計學處理55-56
• 第三章 結(jié)果56-63
• 3.1 從CCP基因群中挑選出PRC156
• 3.2 PRC1的MRNA在前列腺癌細胞株中高表達56-57
• 3.3 前列腺癌細胞株中PRC1蛋白表達量升高57-58
• 3.4 PRC1蛋白在前列腺癌臨床標本中表達上調(diào)58-60
• 3.5 PRC1的MRNA表達量與前列腺癌臨床病理特征之間聯(lián)系60-61
• 3.6 PRC1表達量對于前列腺診斷價值的描述61-63
• 第四章 討論63-66
• 4.1 PRC1與前列腺癌發(fā)生相關(guān)63
• 4.2 PRC1與前列腺癌生化復發(fā)相關(guān)63-64
• 4.3 前列腺癌中PRC1可能的調(diào)控機制64-66
• 第五章 結(jié)論66-67
• 參考文獻67-76
• 本研究的不足之處76-77
• 縮略詞表77-80
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文80-81
• 致謝81-83

【相似文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 羅宏偉;細胞分裂調(diào)節(jié)蛋白1（PRC1）的表達對前列腺癌臨床進展及預后的預測意義[D];南方醫(yī)科大學;2016年

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本文編號：1047598