本文關(guān)鍵詞：人脫落乳牙牙髓干細胞與人恒牙牙髓干細胞成骨分化及破骨能力差異以及調(diào)控機制的初步研究

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【摘要】：[目的]體外分離、培養(yǎng)人脫落乳牙牙髓干細胞和恒牙牙髓干細胞,對比二者一般生物學(xué)特性及成骨誘導(dǎo)和破骨分化能力。篩選并分析SHED參與乳牙牙根生理性吸收過程的關(guān)鍵因子,初步探討SHED可能參與骨改建的調(diào)控機制,為干細胞應(yīng)用于正畸臨床骨改建、加速牙齒移動提供一定實驗依據(jù)。[方法]利用酶消化法、有限稀釋法分離純化獲得SHED及DPSCs。觀察細胞生長及形態(tài),細胞克隆形成率,MTT法測生長曲線,流式細胞儀分析細胞周期。利用礦化誘導(dǎo)液對SHED和DPSCs向成骨細胞誘導(dǎo),分別在誘導(dǎo)14天、21天行堿性磷酸酶染色和茜素紅染色,并對礦化結(jié)節(jié)進行計數(shù)。采用實時熒光定量PCR檢測成骨誘導(dǎo)7d后SHED和DPSCs成破骨相關(guān)基因RUNX2、OCN、COL-1、 ALP. RANKL和OPG的表達情況,初步探討對比SHED和DPSCs的成骨分化及破骨能力差異。RT-PCR檢測SHED和DPSCs的TNF-α、IL-6、NF-κB、OPG、 RANKL表達情況,Western Bolot檢測SHED和DPSCs全細胞蛋白中TNF-α、 NF-κB的表達水平,并進行相關(guān)蛋白表達灰度分析。[結(jié)果] (1)通過酶消化法、有限稀釋純化法獲得了SHED和DPSCs,兩種干細胞的形態(tài)均為成纖維細胞樣,而SHED呈現(xiàn)多形性,有短梭形、扁平形、多角形和橢圓形等形狀,DPSCs可見單個細胞呈梭形、星形,胞漿均勻、核圓、核仁清晰。SHED克隆形成率高于DPSCs,且兩種干細胞之間存在顯著性差異(p0.05)。SHED和DPSCs的生長曲線趨勢均呈“S”型,SHED從第3d開始進入對數(shù)生長期,而DPSCs從第4d進入對數(shù)生長期,且SHED達到峰值顯著高于DPSCs,說明SHED增殖能力強于DPSCs。細胞周期分析結(jié)果,G2/M+S期：SHED為35.54%,DPSCs為24.14%,且差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05),提示SHED具有更強的細胞自我復(fù)制及增殖能力。SHED和DPSCs在成骨向誘導(dǎo)14d后,ALP染色均呈陽性表達,且多數(shù)細胞質(zhì)有藍紫色顆粒沉淀,SHED比DPSCsALP陽性表達率更高;成骨向誘導(dǎo)21d后,茜素紅染色均為陽性,兩種細胞均可見有礦化結(jié)節(jié)形成,SHED的數(shù)量顯著多于DPSCs,且SHED形成結(jié)節(jié)面積較大、稠密,而DPSCs形成分散、面積較小的礦化結(jié)節(jié)。以上結(jié)果可提示SHED較DPSCs有更強成骨分化能力。(2) RT-PCR檢測結(jié)果顯示,成骨誘導(dǎo)后,成骨相關(guān)基因Runx2、OCN、ALP和OPG在SHED和DPSCs中均有表達,SHED的Runx2、OCN、ALP和OPG表達量增加高于DPSCs,該結(jié)果再次證明SHED較DPSCs具有較強成骨分化能力。且兩種細胞均表達OPG和RANKL,在破骨相關(guān)基因RANKL的表達上,與DPSCs相比,SHED呈明顯上調(diào)趨勢,在反應(yīng)細胞破骨與成骨能力的RANKL/OPG比值上,SHED顯著高于DPSCs,結(jié)果表明,與DPSCs相比,SHED還兼具較強的破骨能力。(3) SHED和DPSCs均表達TNF-α、 IL-6、NF-κB等炎性相關(guān)因子,SHED在TNF-α、IL-6、NF-κB表達水平明顯高于對照組DPSCs,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);在TNF-a表達上,SHED表達量約為DPSCs3倍;在IL-6表達上,SHED表達量約為DPSCs 3倍;在NF-κB表達上,SHED表達量約為DPSCs7倍;在RANKL/OPG比值上,SHED約為DPSCs的2.5倍,以上差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 Western Bolot檢測結(jié)果顯示SHED中TNF-a和NF-κB蛋白表達水平顯著高于DPSCs.相關(guān)蛋白表達灰度分析結(jié)果顯示,在TNF-a表達上,SHED是DPSCs的大約2.5倍;在NF-κB表達上,SHED是DPSCs的大約1.9倍,以上差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p.05)。[結(jié)論]本研究成功從人脫落乳牙牙髓和恒牙牙髓中分離出SHED和DPSCs,與DPSCs相比,SHED增殖能力強,倍增時間短,且具有較高克隆形成能力。經(jīng)成骨誘導(dǎo)后,SHED較DPSCs具有更強的成骨分化能力。此外,SHED還兼有較強的破骨能力。在乳牙生理性根吸收、牙根周圍骨改建的過程中,SHED可能通過分泌TNF-α等炎癥因子誘導(dǎo)活化NF-κB信號通路,NF-κB信號通路的激活作用于RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)的調(diào)節(jié),使RANKL/OPG比值明顯變大,促進破骨細胞分化成熟以及牙根周圍骨改建,從而提示SHED可能參與生理性牙根吸收骨改建,為干細胞應(yīng)用于正畸臨床骨改建、加速牙齒移動提供一定實驗及理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：人脫落乳牙牙髓干細胞 恒牙牙髓干細胞 生理性牙根吸收 骨改建 正畸
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R783.5
【目錄】：

• 中英文縮略詞對照表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-16
• 第一部分 人脫落乳牙牙髓干細胞和恒牙牙髓干細胞分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究16-32
• 1.1 材料與方法16-20
• 1.2 結(jié)果20-27
• 1.3 討論27-29
• 1.4 結(jié)論29-30
• 參考文獻30-32
• 第二部分 人脫落乳牙牙髓干細胞與人恒牙牙髓干細胞成骨分化及破骨能力差異的實驗研究32-43
• 2.1 材料與方法32-35
• 2.2 結(jié)果35-39
• 2.3 討論39-40
• 2.4 結(jié)論40-41
• 參考文獻41-43
• 第三部分 人脫落乳牙牙髓干細胞參與生理性根吸收骨改建的調(diào)控機制研究43-55
• 3.1 材料和方法43-46
• 3.2 結(jié)果46-50
• 3.3 討論50-51
• 3.4 結(jié)論51-52
• 參考文獻52-55
• 全文總結(jié)55-57
• 綜述57-69
• 參考文獻64-69
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況69-71
• 致謝71

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本文編號：735566