本文關(guān)鍵詞：阿司匹林對(duì)牙髓干細(xì)胞體外增殖、分化的影響及分子機(jī)制的研究

  更多相關(guān)文章： 阿司匹林 人牙髓干細(xì)胞 成牙分化 MAPK通路 NF-κB通路

【摘要】：人牙髓干細(xì)胞(human pulp stem cell,hDPSCs)是存在于牙髓組織中的未分化細(xì)胞,能夠自我更新,在一定誘導(dǎo)條件下可分化形成牙本質(zhì)樣細(xì)胞,并保持組織的穩(wěn)定性。與其他成體干細(xì)胞相比,人類(lèi)牙源性干細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的增殖活力,并且在不同誘導(dǎo)條件下,均能表現(xiàn)出極強(qiáng)的分化能力;同BMMSCs相較,hDPSCs更易向成牙方向分化,經(jīng)體外誘導(dǎo)高表達(dá)IIIβ-tubulin(TUBB3)、MAP-2證明該細(xì)胞有強(qiáng)烈的神經(jīng)分化潛力,并且這種分化活力的大小同細(xì)胞所處的生長(zhǎng)微環(huán)境關(guān)聯(lián)緊密,不可分割。有研究表明受到炎性刺激的牙髓干細(xì)胞比正常的hDPSCs,ALP、OCN、RUNX-2等成骨基因明顯增加,并有著更強(qiáng)的自我復(fù)制力。因此我們認(rèn)為hDPSCs作為一種內(nèi)源性間充質(zhì)干細(xì)胞可能參與修復(fù)性牙本質(zhì)形成,但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)以及核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)皆是重要的細(xì)胞信號(hào)通路,在多種病理生理機(jī)制和效應(yīng)中有著不可忽視的作用。MAPK是骨缺損模型的重要的調(diào)節(jié)器,影響骨細(xì)胞的吸收跟再生,促進(jìn)骨基質(zhì)沉積跟礦化。已有研究表明,多種藥物可通過(guò)調(diào)節(jié)人間充質(zhì)干細(xì)胞的MAPK的p-JNK、p-p38蛋白表達(dá),影響其成骨向分化;而在hDPSCs中,藥物促進(jìn)細(xì)胞分化則是通過(guò)mapk的p38、erk通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。由此看出,不同干預(yù)條件以及細(xì)胞類(lèi)型mapk調(diào)節(jié)分化的方式有差異。阿司匹林(aspirin)又稱(chēng)乙酰水楊酸(acctylsalicylicacid,asa)是一種非甾體類(lèi)抗炎藥,其療效穩(wěn)定、副反應(yīng)少并且治療范圍廣。百余年來(lái),阿司匹林研究不斷深入,新的藥理作用也不斷發(fā)現(xiàn),阿司匹林有多種生物學(xué)途徑,降低炎性因子水平。阿司匹林在調(diào)控細(xì)胞分化方面也發(fā)揮重要作用,乙酰水楊酸類(lèi)物質(zhì)可以抑骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖分化與遷移,而阿司匹林作為常用抗炎藥物,有關(guān)其對(duì)hdpscs的作用尚不清楚,阿司匹林是否可以調(diào)節(jié)hdpscs的分化,目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究阿司匹林刺激細(xì)胞增殖及分化所用及分化相關(guān)機(jī)制,據(jù)此推測(cè)hdpscs在體內(nèi)的狀態(tài),為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參考。主要研究結(jié)果如下:1、hdpscs的分離、培養(yǎng)和鑒定收集18-25歲健康成年人完好無(wú)齲的正畸牙或第三磨牙聯(lián)合改良組織塊酶消化法,成功分離培養(yǎng)出原代人類(lèi)牙髓細(xì)胞(humandentalpulpcells,hdpcs),采用有限稀釋法挑選出生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)良的單克隆細(xì)胞并擴(kuò)大傳代得到純化的hdpscs,利用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面抗原標(biāo)記cd-105、cd-146等進(jìn)行鑒定,并通過(guò)礦化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其成骨/成牙向分化能力,以此說(shuō)明該細(xì)胞為間充質(zhì)來(lái)源并且可以通過(guò)誘導(dǎo)向成骨/成牙方向分化。2、aspirin對(duì)hdpscs體外增殖能力的影響mtt結(jié)果顯示不同濃度的阿司匹林對(duì)于hdpscs的影響有劑量依賴(lài)性的特點(diǎn)。根據(jù)阿司匹林在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué),分別選5mmol/l、0.5mmol/l、0.05mmol/l、0.005mmol/l的不同濃度的阿司匹林刺激在二維平面空間上生長(zhǎng)的hdpscs一天、三天、五天、七天,當(dāng)阿司匹林濃度為0.05mmol/l和0.005mmol/l培養(yǎng)三天后細(xì)胞擴(kuò)增趨勢(shì)明顯(p0.05),濃度為0.5mmol/l時(shí)同對(duì)照組相比促進(jìn)作用不明顯。當(dāng)濃度大于5mmol/l時(shí),阿司匹林明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)(p0.05),進(jìn)而我們推測(cè)中高濃度的阿司匹林對(duì)hdpscs可能有毒性作用。而細(xì)胞增殖的edu實(shí)驗(yàn)結(jié)果也同mtt結(jié)果相一致。3、Aspirin對(duì)hDPSCs體外分化能力的影響取4代hDPSCs,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%—90%融合時(shí),實(shí)驗(yàn)組為礦化液中加入阿司匹林配制成0.005、0.05、0.5mmol/L的刺激液,單獨(dú)礦化液組及不加礦化液組作為對(duì)照組連續(xù)培養(yǎng)14d茜素紅染色觀察各組礦化結(jié)節(jié)以及PCR技術(shù)檢測(cè)相應(yīng)成骨基因含量表達(dá)情況。茜素紅結(jié)果顯示:肉眼直視下與對(duì)照組相比,0.5mmol/L和0.05mmol/L濃度的阿司匹林能減少礦化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生,且實(shí)驗(yàn)組組間無(wú)明顯差異,但阿司匹林濃度0.005mmol/L時(shí)與對(duì)照組無(wú)明顯差異。倒置顯微鏡下觀察,細(xì)胞狀態(tài)良好,礦化結(jié)節(jié)數(shù)量均一,茜素紅定量結(jié)果同肉眼直視下結(jié)果并無(wú)差異。PCR結(jié)果顯示,同對(duì)照組相比,0.5mmol/L、0.05mmol/L的阿司匹林礦化組的ALP、OCN、DMP1基因均有不同程度的下調(diào),其中0.5mmol/L藥物刺激組最明顯。由此我們推測(cè)Aspirin可能對(duì)hDPSCs礦化產(chǎn)生抑制的作用。4、Aspirin對(duì)hDPSCs體外分化能力作用機(jī)制的研究取4代hDPSCs加入0.5mmol/L阿司匹林,誘導(dǎo)時(shí)間分別為15min、30min、60min,以10%ɑ-MEM作為對(duì)照組。提取總蛋白,利用免疫印跡技術(shù)探究絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)以及核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信號(hào)通路在阿司匹林干預(yù)hDPSCs礦化中的作用。與對(duì)照組相比,0.5mmol/L阿司匹林可抑制礦化結(jié)節(jié)的形成;Western blot結(jié)果顯示隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)p-p38、p-JNK的表達(dá)量均明顯下降,NF-κB表達(dá)上調(diào),而p-ERK表達(dá)則無(wú)明顯變化。進(jìn)行礦化誘導(dǎo)14天,阿司匹林加相應(yīng)通路抑制劑組以及礦化組作為對(duì)照,相關(guān)通路抑制劑包括MAPK(ERK、JNK和P38)抑制劑(U0126、SP600125和SB203580),NF-κB的P65抑制劑PDTC,茜素紅染色觀察其礦化結(jié)節(jié)的多少,其肉眼觀和鏡下結(jié)果同western結(jié)果相一致。依照上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們猜測(cè),阿司匹林抑制牙髓干細(xì)胞成牙向分化可能是通過(guò)影響MAPK的p38、JNK、NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的,而ERK可能不參與。進(jìn)一步深入研究阿司匹林對(duì)hDPSCs作用的細(xì)胞其他信號(hào)途徑,將有利于探討臨床應(yīng)用此藥物時(shí)對(duì)牙髓干細(xì)胞的影響,有利于進(jìn)一步探索其在牙髓再生方面的應(yīng)用。
【關(guān)鍵詞】：阿司匹林 人牙髓干細(xì)胞 成牙分化 MAPK通路 NF-κB通路
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R78
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-23
• 第一部分 hDPSCs的分離培養(yǎng)與鑒定23-29
• 1 材料23-24
• 2 方法24-26
• 3 結(jié)果26-27
• 4 討論27-29
• 第二部分 阿司匹林對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖能力影響的研究29-35
• 1 材料30-31
• 2 方法31-32
• 3 結(jié)果32-33
• 4 討論33-35
• 第三部分 阿司匹林對(duì)牙髓干細(xì)胞骨向/牙向分化能力的作用35-43
• 1 材料36-37
• 2 方法37-40
• 3 結(jié)果40-41
• 4 討論41-43
• 第四部分 阿司匹林對(duì)牙髓干細(xì)胞分化機(jī)制的研究43-49
• 1 材料44-45
• 2 步驟45-47
• 3 結(jié)果47-48
• 4 討論48-49
• 小結(jié)49-50
• 參考文獻(xiàn)50-60
• 附錄60-67
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果67-68
• 致謝68

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本文編號(hào)：731007