本文關鍵詞：促進骨髓間充質干細胞歸巢修復骨質疏松大鼠牙槽骨缺損的實驗研究

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【摘要】：背景全身系統(tǒng)性疾病或口頜系統(tǒng)疾病導致的牙周骨組織缺損再修復,是困擾患者更是口腔醫(yī)生的難題,同時在骨質疏松患者中表現(xiàn)尤為明顯。隨著社會“老齡化”程度的加重,許多由衰老導致的慢性疾病困擾人們的生活與健康。其中婦女絕經(jīng)后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMO),是骨質疏松癥中患病人群最多的一類骨代謝性疾病。據(jù)研究報道,此類患者牙槽骨同時具有骨密度減低、漸進性骨破壞以及牙槽嵴高度喪失的病理性改變,使得其牙周骨缺損修復更是難上加難�？梢�,進一步了解骨質疏松癥的病因并且探索骨質疏松條件下的牙周骨缺損修復的治療途徑具有重要的臨床意義。隨著對骨質疏松癥病因的不斷深入了解,骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived MSCs,BMSCs)被證實在骨質疏松癥宿主體內通過影響骨組織與脂肪組織的改建與形成參與了骨質疏松的發(fā)病機制。但是作為干細胞在局部發(fā)揮成骨替代效應的前提,骨質疏松癥患者體內BMSCs的“歸巢”問題應被引起關注。目前尚未有研究對BMSCs的遷移與歸巢能力是否具有病理性缺陷做出報道。已被證實的參與細胞遷移及歸巢的分子中,基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1α)及其受體CXCR4是研究最為廣泛且重要的因子。SDF-1α通過與其受體CXCR4結合可以調控BMSCs的趨化遷移能力,但是尚未有研究對骨質疏松癥的BMSCs與此生物軸的相關生物學作用進行探討。大量研究證明利用外源性BMSCs的自我增殖以及骨向分化能力治療慢性骨疾病或修復骨缺損是有效的方法。其中BMSCs的移植方法主要分為系統(tǒng)性移植以及局部移植。局部移植BMSCs是進行牙周骨再生常用的組織工程策略,但是具有對移植環(huán)境及緩釋材料生物性能要求高、植入的細胞數(shù)量不穩(wěn)定、歸巢至損傷部位數(shù)量較少等缺點。系統(tǒng)性移植BMSCs是骨質疏松全身性治療的有效方法,其優(yōu)點是干細胞在宿主體內微環(huán)境的影響下更易隨著血循環(huán)進入損傷部位,缺點是有報道認為移植的細胞會被大量堆積在肝臟及肺部等。但是目前鮮有研究對系統(tǒng)性移植BMSCs治療骨質疏松牙周骨缺損做出報道。本研究首次將全身治療骨質疏松疾病系統(tǒng)性移植BMSCs的方法與牙周骨缺損的治療相結合,主要對SDF-1α/CXCR4生物軸誘導下系統(tǒng)性移植BMSCs修復牙槽骨損傷的募集作用進行評估,希望通過局部SDF-1α的誘導作用促進外源性BMSCs甚至內源性BMSCs的歸巢來促進骨質疏松牙槽骨缺損部位的再生修復。目的本研究體外實驗首先建立大鼠骨質疏松模型,分離培養(yǎng)骨質疏松與正常大鼠的骨髓間充質干細胞,體外比較兩種細胞的一般生物學特性以及與SDF-1α/CXCR4軸相關的生物學特性,探討此生物軸對去勢大鼠BMSCs趨化能力的影響及相關分子機制。為骨質疏松疾病對內源性BMSCs的病理性影響提供理論依據(jù)。體內實驗建立骨質疏松大鼠牙槽骨缺損模型后,將體外培養(yǎng)擴增的同種正常BMSCs系統(tǒng)移植入大鼠體內,同時在缺損局部將SDF-1α與緩釋材料復合后植入缺損部位,評價系統(tǒng)移植BMSCs的局部歸巢以及成骨分化效果。為骨質疏松患者的牙周骨缺損及再生修復提供新的治療途徑及依據(jù)。方法1.建立絕經(jīng)后大鼠骨質疏松模型,并用Micro-CT以及力學方法進行模型驗證。分離培養(yǎng)來自正常大鼠(Sham組)與骨質疏松大鼠(OVX組)的BMSCs,對二者的一般生物學特性,包括克隆形成能力、增殖能力、免疫分子表型、以及成骨與成脂分化能力進行鑒定與對比。2.通過流式細胞儀鑒定法、免疫熒光染色法、q RT-PCR、Western-Blot對上述兩組細胞表面及細胞內的CXCR4表達進行鑒定。通過Transwell實驗對兩組BMSCs在SDF-1α的誘導下趨化遷移能力進行對比;通過Western-Blot進一步對比兩組BMSCs在SDF-1α誘導下遷移相關通路AKT以及ERK的磷酸化水平。3.慢病毒轉染法上調OVX-BMSCs的CXCR4表達,通過q RT-PCR、Western-Blot法對上調結果進行驗證;Transwell實驗進一步驗證上調組細胞遷移能力的變化。4.用SDF-1α局部誘導系統(tǒng)移植的BMSCs來修復骨質疏松大鼠牙槽骨缺損。建立大鼠牙槽骨缺損模型后,局部植入SDF-1α復合水凝膠緩釋材料,同時系統(tǒng)性移植體外標記CM-Dil的同種異體BMSCs。4周后,通過Micro-CT掃描和三維重建技術對缺損部位的骨再生進行評價;利用HE及馬松染色觀察微觀骨形成;利用免疫熒光技術觀察BMSCs在牙槽骨缺損部位的歸巢及分化為成骨基因陽性細胞的情況。進一步利用組織PCR技術檢測新生骨區(qū)域的相關成骨標志性基因以及CXCR4的表達。結果1.(1)經(jīng)Micro-CT及力學檢測,OVX組比Sham組大鼠股骨的骨組織密度(BMD)、骨礦含量(BMC)、骨小梁比值(BV/TV)以及力學數(shù)據(jù)最大載荷量(Max Load)都大,證明骨質疏松動物模型建立成功。(2)比較Sham-BMSCs與OVX-BMSCs一般生物學特性后結果顯示:兩者細胞在細胞形態(tài)、培養(yǎng)過程、克隆形成率方面沒有明顯差異,但OVX-BMSCs較Sham-BMSCs的增殖能力稍強。多向分化能力鑒定結果顯示:OVX-BMSCS較Sham-BMSCs的成骨分化能力減弱,成脂能力增強。2.(1)比較Sham-BMSCs與OVX-BMSCs的CXCR4表達結果顯示:CXCR4受體在兩組細胞均為胞核高表達、包膜低表達,OVX-BMSCs較Sham-BMSCs低;并且隨著體外培養(yǎng)代數(shù)的增加,兩組細胞的CXCR4表達均減弱。(2)比較Sham-BMSCs與OVX-BMSCs趨化遷移能力后結果顯示:兩者細胞都在SDF-1α為100ng/ml時的遷移數(shù)量最多;相同SDF-1α濃度下OVX組的遷移能力低于Sham組;CXCR4受體阻斷劑AMD3100可明顯降低兩種細胞的遷移速率,說明CXCR4與OVX-BMSCs的遷移密切相關。(3)比較Sham-BMSCs與OVX-BMSCs在SDF-1α誘導下AKT與ERK通路的磷酸化水平。AKT結果顯示:Sham組在30min時磷酸化水平顯著上升達到最大值,60分鐘時開始下降;而OVX組則在30-60min之間,甚至60min時出現(xiàn)磷酸化水平的最高點。ERK結果顯示:Sham組也在30min時ERK磷酸化水平明顯升高,60min時稍降低,120min時較60min沒有明顯變化;而OVX組在60min時磷酸化水平明顯增高,120min與60min時不具明顯差異。相同時間點比較時發(fā)現(xiàn),加抑制劑組比未加抑制劑組的AKT及ERK磷酸化水平明顯降低,并且在不同時間點時的磷酸化與上述不加抑制劑組趨勢相似。以上說明OVX組的AKT與ERK磷酸化水平及敏感度較Sham組減弱,并且這一過程與CXCR4的表達密切相關。3.上調OVX-BMSCs的CXCR4表達后遷移能力檢測:熒光顯微鏡下觀察EGFP轉染BMSCs陽性率大于80%以上,q RT-PCR與Western blot證明上調組BMSCs的CXCR4m RNA及蛋白水平明顯升高。趨化遷移實驗結果顯示CXCR4-OVX-BMSCs體外遷移能力明顯升高。4.(1)體內實驗結果顯示:移植手術4周后用Micro-CT對新生骨組織進行CT值分析以及BMD分析,結果顯示系統(tǒng)性移植組(im-BMSCs)組比空白對照組骨再生情況較佳;局部誘導組(SDF-1α+im-BMSCs)骨再生情況明顯優(yōu)于im-BMSCs及空白對照組。(2)HE染色及馬松三色染色結果顯示:SDF-1α+im-BMSCs組新骨內有更多的富含膠原的新骨及成骨細胞,而單純im-BMSCs與空白對照組的纖維結締組織較多。(3)免疫熒光染色結果顯示:SDF-1α+im-BMSCs組較im-BMSCs組與空白對照組局部歸巢的細胞明顯增多,且SDF-1α+im-BMSCs組歸巢至局部的細胞表達成骨基因Runx2及OCN的陽性表達增多,說明更多的BMSCs發(fā)生了成骨分化。(4)組織PCR結果顯示,SDF-1α+im-BMSCs較空白對照及im-BMSCs組Runx2及OCN的表達升高,并且CXCR4的表達也升高顯著,提示SDF-1α+im-BMSCs組牙槽骨缺損再生的新骨組織募集了大量的CXCR4陽性表達的細胞。結論1.OVX-BMSCs較Sham-BMSCs的增殖能力增強,成骨能力減弱,成脂能力增強。SDF-1α誘導后OVX-BMSCs較Sham-BMSCs的體外遷移能力較弱,與其CXCR4的表達降低有關。上調OVX-BMSCs表面的CXCR4基因,可以增強其體外遷移能力。2.局部植入SDF-1α緩釋水凝膠可以增加系統(tǒng)性移植BMSCs向骨質疏松大鼠牙槽骨缺損歸巢的數(shù)量,并且通過成骨分化后參與局部骨組織的修復與再生;局部SDF-1α的移植也可能引起內源性BMSCs的歸巢。
【關鍵詞】：絕經(jīng)后骨質疏松 骨髓間充質干細胞 SDF-1α/CXCR4 AMD3100 細胞歸巢 成骨分化
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R580;R783
【目錄】：

• 縮略語表5-8
• 中文摘要8-13
• 英文摘要13-19
• 前言19-21
• 文獻回顧21-43
• 第一部分 正常（Sham）與PMO大鼠（OVX）BMSCs的一般生物學特性比較43-62
• 實驗一 大鼠骨質疏松模型的建立與驗證43-46
• 1 材料43
• 2 方法43-44
• 3 結果44-46
• 實驗二 Sham-BMSCS與OVX-BMSCS的分離、培養(yǎng)、及鑒定46-62
• 1 實驗材料46-47
• 2 實驗方法47-52
• 3 實驗結果52-60
• 4 討論60-62
• 第二部分 正常（Sham）與PMO大鼠（OVX）BMSCs遷移能力比較62-81
• 實驗一 Sham-BMSCS與OVX-BMSCS表達CXCR4受體水平的鑒定63-71
• 1 實驗材料63-64
• 2 實驗方法64-66
• 3 實驗結果66-69
• 4 討論69-71
• 實驗二 體外對比Sham-BMSCS與OVX-BMSCS趨化遷移能力71-75
• 1 實驗材料71
• 2 試驗方法71-72
• 3 實驗結果72-73
• 4 討論73-75
• 實驗三 Sham-BMSCS與OVX-BMSCS相關AKT與ERK通路磷酸化水平的研究75-81
• 1 實驗材料75
• 2 實驗方法75-76
• 3 實驗結果76-79
• 4 討論79-81
• 第三部分 基因轉染提高PMO大鼠BMSCs趨化能力的研究81-86
• 1 實驗材料81
• 2 實驗方法81-82
• 3 實驗結果82-84
• 4 討論84-86
• 第四部分 促進BMSCs歸巢修復骨質疏松大鼠牙槽骨缺損的體內研究86-102
• 1 實驗材料86-87
• 2 實驗方法87-91
• 3 實驗結果91-99
• 4 討論99-102
• 小結102-104
• 參考文獻104-125
• 個人簡歷和研究成果125-127
• 致謝127

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本文編號：700369