本文關(guān)鍵詞：尼古丁調(diào)控miR-30a生成影響牙周膜細(xì)胞細(xì)胞周期和炎性反應(yīng)機(jī)制研究

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【摘要】：牙周炎(periodontitis)作為口腔健康的頭號(hào)殺手,主要由菌斑引起的直接細(xì)胞毒作用及宿主對(duì)菌斑微生物的免疫應(yīng)答導(dǎo)致牙周組織損傷,進(jìn)一步引起牙周支持組織喪失,導(dǎo)致牙齒缺失。越來越多的研究證實(shí)在牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中存在多種mi RNAs的表達(dá)變化,提示它們?cè)谘乐苎装l(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。然而,其究竟通過何種途徑來影響牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程,尚需大量研究證實(shí)。吸煙作為牙周炎重要的危險(xiǎn)因素,煙草中的主要成分尼古丁在牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。課題組前期研究通過構(gòu)建牙周炎大鼠模型、體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞,尼古丁作用于實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠和人牙周膜細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)煙堿型乙酰膽堿受體α7亞型(alpha7 nicotinic acetylcholine receptor,α7 n ACh R)在實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠牙周組織和和人牙周膜細(xì)胞的表達(dá)均顯著升高,α7 n ACh R特異性拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BTX)可拮抗該效應(yīng),進(jìn)而參與吸煙相關(guān)性牙周炎發(fā)生發(fā)展過程。另有研究表明,尼古丁、α7 n ACh R可能通過調(diào)控多種mi RNAs表達(dá)水平,參與多種心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程。然而關(guān)于尼古丁、α7 n ACh R調(diào)控mi RNAs參與牙周疾病乃至口腔疾病發(fā)生發(fā)展的研究卻鮮有報(bào)道。由此,我們猜想:尼古丁激活人牙周膜細(xì)胞α7 n ACh R后可能會(huì)通過mi RNAs進(jìn)一步參與吸煙促牙周組織炎性損傷和抑制牙周組織修復(fù)過程。但是其具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本研究將深入探討mi RNAs在吸煙相關(guān)性牙周炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用,為牙周炎的防治提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)�！灸康摹俊灸康摹勘菊n題擬從尼古丁調(diào)控牙周膜細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞增殖、STAT3信號(hào)通路等方面入手,系統(tǒng)探討尼古丁可能通過調(diào)控牙周膜細(xì)胞mi R-30a表達(dá)水平,進(jìn)而調(diào)節(jié)NF-κB-mi R-30a-STAT3反饋環(huán)路和CCNE2參與牙周組織炎性損傷和組織修復(fù)過程的機(jī)制;探索基于mi R-30a調(diào)節(jié)途徑出發(fā)降低尼古丁促牙周炎患者的牙周組織損傷和抑制牙周組織修復(fù)效應(yīng),為有效預(yù)防及治療吸煙相關(guān)性牙周炎提供新的理論依據(jù)�！痉椒ā�1.組織塊法進(jìn)行牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng);在成功培養(yǎng)原代牙周膜細(xì)胞后進(jìn)行常規(guī)傳代。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)鑒定細(xì)胞表型;待牙周膜細(xì)胞傳至第五代時(shí),給予細(xì)胞尼古丁處理,micro RNA芯片檢測(cè)尼古丁處理后牙周膜細(xì)胞mi RNAs表達(dá)情況,選取與細(xì)胞增殖和炎性反應(yīng)密切相關(guān)的mi RNAs進(jìn)行q PCR驗(yàn)證,考慮到mi R-30家族成員成熟形式差異較小,故通過擴(kuò)增其前體形式來比較表達(dá)差異。2.分別給予第5代牙周膜細(xì)胞10-5M尼古丁和/或10-8Mα-BTX和/或mi R-30a inhibitor處理;MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況,流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析各組細(xì)胞周期分布情況,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組牙周膜細(xì)胞mi R-30a表達(dá)情況,實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞CCNE2的m RNA和蛋白表達(dá)情況。構(gòu)建CCNE2 3’UTR野生型和突變型報(bào)告基因載體,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證mi R-30a是否可以直接結(jié)合CCNE2 3’UTR區(qū);設(shè)計(jì)CCNE2干擾RNA,驗(yàn)證CCNE2在調(diào)節(jié)牙周膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期中的作用。3.分別給予第5代牙周膜細(xì)胞10-5M尼古丁和/或10-8Mα-BTX和/或mi R-30a inhibitor處理;采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞SOCS3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性因子m RNA和蛋白表達(dá)情況,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)尼古丁對(duì)STAT3活性水平的影響。構(gòu)建SOCS3 3’UTR野生型和突變型報(bào)告基因載體,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證mi R-30a是否可以直接結(jié)合SOCS3 3’UTR區(qū);設(shè)計(jì)SOCS3干擾RNA,驗(yàn)證SOCS3在調(diào)節(jié)牙周膜細(xì)胞JAK2-STAT3信號(hào)通路中的作用。4.尼古丁可顯著上調(diào)pre-mi R-30a表達(dá),提示尼古丁對(duì)mi R-30a的抑制作用可能發(fā)生于轉(zhuǎn)錄起始水平。因而,我們對(duì)mi R-30a的潛在宿主基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)mi R-30a宿主基因的啟動(dòng)子區(qū)存在轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)。分別給予第5代牙周膜細(xì)胞10-5M尼古丁和/或拮抗劑10-8Mα-BTX和/或5x10-5M PDTC和/或10-6M Cucurbitacin I處理;采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞mi R-30a表達(dá)水平,Western blot實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κB p65蛋白表達(dá)水平和NF-κB活性水平�！窘Y(jié)果】1.體外成功進(jìn)行人牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng)。待細(xì)胞聚合生長至90%時(shí),常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞傳代,流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面高表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞表型CD29、CD105,低表達(dá)細(xì)胞表型CD31、CD14,提示細(xì)胞來源于間充質(zhì);給予第5代牙周膜細(xì)胞尼古丁作用后進(jìn)行micro RNA芯片檢測(cè),發(fā)現(xiàn)有20個(gè)micro RNAs上調(diào);16個(gè)micro RNAs下調(diào);選擇與炎性反應(yīng)和細(xì)胞增殖密切相關(guān)的mi R-30a、let-7f、mi R-21及l(fā)et-7e進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)10-5M尼古丁可顯著上調(diào)牙周膜細(xì)胞pre-mi R-30a表達(dá)水平,且呈時(shí)間依賴性;而let-7f、mi R-21及l(fā)et-7e表達(dá)水平無明顯規(guī)律,故最終確定mi R-30a進(jìn)行深入研究。2.尼古丁可抑制牙周膜細(xì)胞增殖能力,轉(zhuǎn)染mi R-30a inhibitor可逆轉(zhuǎn)尼古丁對(duì)牙周膜細(xì)胞增殖能力的抑制效應(yīng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;另外,尼古丁可抑制牙周膜細(xì)胞周期蛋白CCNE2表達(dá),誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯,導(dǎo)致其合成DNA能力下降,進(jìn)而影響其增殖過程。給予人牙周膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-30a inhibitor可干擾牙周膜細(xì)胞內(nèi)mi R-30a的表達(dá);進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),抑制mi R-30a的表達(dá)可調(diào)節(jié)尼古丁影響的牙周膜細(xì)胞CCNE2表達(dá)水平,削弱尼古丁抑制的牙周膜細(xì)胞周期進(jìn)程;雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)mi R-30a可直接結(jié)合CCNE2 3’UTR區(qū),調(diào)控其表達(dá)水平;干擾CCNE2表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)CCNE2是調(diào)控牙周膜細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子,進(jìn)而影響其增殖能力。3.尼古丁可激活牙周膜細(xì)胞JAK2-STAT3信號(hào)通路,參與牙周組織炎性反應(yīng)過程,表現(xiàn)為:尼古丁可明顯上調(diào)磷酸化的JAK2和STAT3蛋白表達(dá)水平和STAT3活性水平。對(duì)STAT3抑制劑Cucurbitacin I進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),10-5M和10-6MCucurbitacin I均可抑制磷酸化STAT3蛋白表達(dá)水平,而10-5M Cucurbitacin I細(xì)胞毒性較大,細(xì)胞壞死較多,而10-7M Cucurbitacin I抑制STAT3能力較低,故選擇10-6M Cucurbitacin I作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)濃度。另外,尼古丁激活JAK2-STAT3信號(hào)通路后,還可上調(diào)下游炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α表達(dá)水平,10-6M Cucurbitacin I可拮抗尼古丁的激活效應(yīng),提示尼古丁可通過JAK2-STAT3參與吸煙相關(guān)性牙周炎炎性損傷過程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),抑制mi R-30a的表達(dá)可調(diào)節(jié)尼古丁對(duì)JAK2-STAT3信號(hào)通路的激活效應(yīng),削弱尼古丁誘導(dǎo)的牙周組織炎性反應(yīng)過程;雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)mi R-30a可直接結(jié)合SOCS3 3’UTR區(qū),調(diào)控其表達(dá)水平;干擾SOCS3表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)SOCS3是調(diào)控牙周膜細(xì)胞JAK2-STAT3信號(hào)通路激活與否的關(guān)鍵因子。4.Western blot和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)尼古丁可激活牙周膜細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路;另外,對(duì)mi R-30a宿主基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5000bp至下游1000bp的DNA區(qū)域的分析表明,在該區(qū)域里存在NF-κB結(jié)合位點(diǎn);當(dāng)PDTC抑制NF-κB表達(dá)后,mi R-30a的表達(dá)水平也受到抑制,提示NF-κB可能通過調(diào)控mi R-30a的啟動(dòng)子區(qū)影響其表達(dá)水平。而STAT3信號(hào)通路抑制劑Cucurbitacin I也能下調(diào)p65蛋白表達(dá)和NF-κB活性水平,進(jìn)而構(gòu)成NF-κB-mi R-30a-STAT3反饋環(huán)路參與牙周組織炎性損傷過程�！窘Y(jié)論】1.成功培養(yǎng)鑒定人牙周膜細(xì)胞,micro RNA芯片和實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)尼古丁可能通過上調(diào)mi R-30a表達(dá)水平參與吸煙相關(guān)性牙周炎發(fā)生發(fā)展過程。2.尼古丁可通過上調(diào)人牙周膜細(xì)胞mi R-30a表達(dá)水平,來靶向下調(diào)CCNE2表達(dá)水平,促進(jìn)牙周膜細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯,進(jìn)而抑制牙周膜細(xì)胞增殖能力,參與吸煙抑制牙周組織修復(fù)過程。3.尼古丁通過上調(diào)人牙周膜細(xì)胞mi R-30a表達(dá)水平,來靶向下調(diào)SOCS3表達(dá)水平,解除其對(duì)牙周膜細(xì)胞STAT3信號(hào)通路的抑制作用,導(dǎo)致牙周膜細(xì)胞STAT3信號(hào)通路的持續(xù)激活,進(jìn)而參與吸煙促進(jìn)牙周組織炎性損傷過程。4.尼古丁可能通過調(diào)節(jié)NF-κB活性水平來調(diào)控牙周膜細(xì)胞mi R-30a表達(dá);STAT3又能反饋調(diào)控NF-κB活性水平,從而構(gòu)成一個(gè)NF-κB-mi R-30a-STAT3反饋環(huán)路,參與吸煙相關(guān)性牙周炎牙周組織炎性損傷過程。
【關(guān)鍵詞】：尼古丁 牙周炎 牙周膜細(xì)胞 煙堿型乙酰膽堿受體α7亞型 微小RNA-30a 細(xì)胞周期蛋白E2 細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子3
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R781.4
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 前言18-20
• 文獻(xiàn)回顧20-39
• 第一部分 尼古丁處理牙周膜細(xì)胞表達(dá)mi R-30a的篩選與鑒定39-52
• 1 材料39-40
• 2 方法40-45
• 3 結(jié)果45-49
• 4 討論49-52
• 第二部分 尼古丁上調(diào)mi R-30a影響牙周膜細(xì)胞增殖和周期的研究52-87
• 實(shí)驗(yàn)一 尼古丁影響牙周膜細(xì)胞增殖與周期的研究52-61
• 1 材料52-53
• 2 方法53-57
• 3 結(jié)果57-59
• 4 討論59-61
• 實(shí)驗(yàn)二 尼古丁上調(diào)mi R-30a影響牙周膜細(xì)胞增殖與周期的研究61-72
• 1 材料61-62
• 2 方法62-64
• 3 結(jié)果64-69
• 4 討論69-72
• 實(shí)驗(yàn)三mi R-30a通過CCNE2調(diào)控牙周膜細(xì)胞增殖與周期的研究72-87
• 1 材料72-73
• 2 方法73-79
• 3 結(jié)果79-84
• 4 討論84-87
• 第三部分 尼古丁上調(diào)mi R-30a影響STAT3通路的研究87-112
• 實(shí)驗(yàn)一 尼古丁影響牙周膜細(xì)胞STAT3通路的研究87-95
• 1 材料87-88
• 2 方法88-89
• 3 結(jié)果89-92
• 4 討論92-95
• 實(shí)驗(yàn)二 尼古丁上調(diào)mi R-30a影響牙周膜細(xì)胞STAT3通路的研究95-102
• 1 材料95-96
• 2 方法96-97
• 3 結(jié)果97-99
• 4 討論99-102
• 實(shí)驗(yàn)三 mi R-30a通過SOCS3調(diào)控牙周膜細(xì)胞STAT3通路的研究102-112
• 1 材料102-103
• 2 方法103-105
• 3 結(jié)果105-109
• 4 討論109-112
• 第四部分 尼古丁激活NF-ΚB調(diào)控mi R-30a表達(dá)的研究112-120
• 1 材料112-113
• 2 方法113-116
• 3 結(jié)果116-118
• 4 討論118-120
• 小結(jié)120-122
• 參考文獻(xiàn)122-137
• 附錄137-140
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果140-143
• 致謝143-144

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本文編號(hào)：691465