本文關(guān)鍵詞：恥骨松弛激素對(duì)TMJ髁狀突軟骨和骨代謝的影響及機(jī)制研究

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【摘要】：顳下頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征(TMD)是一類累及顳下頜關(guān)節(jié)及周圍咀嚼肌肉系統(tǒng)的疾病,嚴(yán)重TMD患者常發(fā)生髁狀突關(guān)節(jié)軟骨的退化和軟骨下骨組織的破壞。TMD的發(fā)病率表現(xiàn)為女性顯著高于男性,尤其在生殖期女性中達(dá)到高峰,然而其發(fā)病表現(xiàn)出明顯性別和年齡特征的原因尚不清楚。盡管雌激素、雄激素、孕激素等生殖激素與TMD發(fā)病之間的相關(guān)性得到了廣泛研究,但目前仍沒有直接證據(jù)證明這些生殖激素和TMD相關(guān),它們發(fā)揮作用的內(nèi)在機(jī)制亦有待于進(jìn)一步闡明。近年來,與分娩密切相關(guān)的恥骨松弛激素(RLN)逐漸走進(jìn)了學(xué)者們的視野。RLN主要由雌性動(dòng)物的卵巢、黃體等分泌,在分娩時(shí)發(fā)揮松弛盆腔韌帶的生理學(xué)作用。RLN細(xì)胞學(xué)作用十分廣泛：其不僅能誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶如MMP1、MMP3、MMP9和MMP13的表達(dá),促進(jìn)膠原降解；還能作用于人造血祖細(xì)胞和成熟的破骨細(xì)胞,促進(jìn)其分化和成熟。在以上細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,本課題旨在探討RLN在TMJ髁狀突軟骨和骨破壞過程中的作用并明確其相關(guān)機(jī)制。本研究第一部分旨在研究全身緩釋RLN對(duì)小鼠髁狀突軟骨和骨的影響。我們應(yīng)用ALZET微滲透泵通過全身緩釋的方式投給RLN,4周后處死動(dòng)物取其雙側(cè)髁狀突并在體視顯微鏡下分離成關(guān)節(jié)軟骨和骨兩部分。在關(guān)節(jié)軟骨方面,進(jìn)行葡萄糖胺聚糖(GAGs)和膠原(collagen)含量測定以明確RLN對(duì)關(guān)節(jié)軟骨主要成分的影響；HE染色觀察髁狀突關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)的改變；并應(yīng)用基因芯片、免疫組織化學(xué)、RT-PCR、western blot等方法從基因和蛋白角度檢測細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)因子的改變。在骨組織方面,采用Micro CT觀察RLN對(duì)髁狀突骨量和骨結(jié)構(gòu)的影響；并應(yīng)用免疫組織化學(xué)、RT-PCR、western blot等方法檢測破骨細(xì)胞數(shù)目以及功能的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：1.RLN作用后髁狀突關(guān)節(jié)軟骨中GAGs和collagen的含量減少,關(guān)節(jié)軟骨變��；2.RLN能上調(diào)關(guān)節(jié)軟骨中多種金屬蛋白酶的表達(dá),其中MMP9和MMP13上升最為顯著；3.RLN作用后,髁狀突骨小梁數(shù)量變少、厚度變薄；4.RLN能使破骨細(xì)胞數(shù)目增加并刺激破骨細(xì)胞相關(guān)基因RANK、MMP9、Cathepsin K的表達(dá)；5.RLN促進(jìn)RANKL的表達(dá),從而使RANKL/OPG比例增加。綜上,RLN一方面促進(jìn)髁狀突關(guān)節(jié)軟骨降解,而MMP9、MMP13兩種因子在這一過程中起關(guān)鍵作用；另一方面其能促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成、增強(qiáng)其活性從而引起髁狀突骨小梁的破壞。第一部分研究結(jié)果提示MMP9和MMP13在RLN引起的髁狀突關(guān)節(jié)軟骨降解過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在此基礎(chǔ)上,本研究第二部分選用MMP9-/-和MMP13-/-小鼠模型,旨在明確MMP9和MMP13在RLN誘導(dǎo)的髁狀突軟骨和骨破壞過程中的精確作用。本研究在WT型、MMP9-/-、MMP13-/-三種基因型小鼠中分別投給RLN,具體實(shí)驗(yàn)方法和檢測指標(biāo)同第一部分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：1.在MMP9-/-小鼠中,RLN能刺激MMP13的代償性增加,最終表現(xiàn)為和WT型小鼠相似的關(guān)節(jié)軟骨降解現(xiàn)象；2.在MMP13-/-小鼠中,RLN雖能刺激MMP9的表達(dá),但對(duì)關(guān)節(jié)軟骨中GAGs、collagen含量及關(guān)節(jié)軟骨厚度無影響；3.在WT型、MMP9-/-和MMP13-/-三種基因型小鼠中,RLN均能使髁狀突骨小梁數(shù)量變少、厚度變��；4.RLN增加破骨細(xì)胞數(shù)目以及對(duì)破骨細(xì)胞相關(guān)基因RANK、MMP9、CathepsinK的刺激作用在三種基因型小鼠中相似；5.RLN在三種基因型小鼠中均促進(jìn)RANKL的表達(dá),從而使RANKL/OPG比例增加。以上結(jié)果提示MMP9和MMP13在RLN誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨降解過程中存在一定的相互代償作用,而MMP13的作用更為關(guān)鍵；MMP9和MMP13在RLN誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成和骨吸收方面均不起決定性作用。RLN受體-松弛素家族肽(RXFP)的水平直接決定了RLN的生物學(xué)功能。RXFP包括RXFP1-4四個(gè)成員,其中RLN能與RXFP1和RXFP2結(jié)合。有報(bào)道提出RLN與RXFP1具有高度親和力而和RXFP2親和性較低,而RXFP1和RXFP2介導(dǎo)的生物學(xué)作用顯著不同。本課題第三部分旨在確定RXFP1和RXFP2兩種受體在RLN誘導(dǎo)的髁狀突軟骨和骨破壞過程中的具體作用。我們分別設(shè)計(jì)合成shRNA-RXFP1和shRNA-RXFP2'慢病毒顆粒,并將其注射到小鼠顳下頜關(guān)節(jié)腔內(nèi),以期建立髁狀突局限性RXFP1和RXFP2沉默小鼠模型。首先應(yīng)用RT-PCR和western blot檢測正常型、shRXFP1、shRXFP2三種小鼠髁狀突組織中RXFP1和RXFP2的表達(dá)水平,以驗(yàn)證慢病毒顆粒的特異性和效果。在此基礎(chǔ)上,我們分別檢測了三種動(dòng)物投給RLN前后髁狀突關(guān)節(jié)軟骨中GAGs、collagen的含量,MMP9、MMP13的表達(dá)情況以及髁狀突骨組織的含量和破骨細(xì)胞功能等,具體方法同第一部分。此外,我們通過RT-PCR檢測了三種動(dòng)物在RLN的作用下髁狀突骨組織中ALP、COLI、OCN、TGF-β、OPN等成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：1. shRXFP1和shRXFP2小鼠分別表現(xiàn)為髁狀突RXFP1和RXFP2受體表達(dá)的特異性減弱,且減弱程度不受RLN影響；2. shRXFP1小鼠經(jīng)RLN作用后髁狀突關(guān)節(jié)軟骨中GAGs、collagen的含量及MMP9、MMP13的表達(dá)均無明顯變化；并且RLN對(duì)shRXFP1小鼠髁狀突骨量和破骨相關(guān)基因的表達(dá)無明顯影響；3. shRXFP2小鼠經(jīng)RLN作用后髁狀突關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的改變與正常型小鼠基本相似；4. shRXFP2小鼠較正常型小鼠髁狀突骨小梁明顯減少,骨質(zhì)結(jié)構(gòu)較為稀疏,成骨相關(guān)基因ALP、COLI、OCN表達(dá)減弱；5.RLN能刺激shRXFP1小鼠成骨相關(guān)基因的表達(dá),而在正常型和shRXFP2小鼠中RLN對(duì)成骨相關(guān)基因無作用。以上結(jié)果提示RXFP1介導(dǎo)了RLN的關(guān)節(jié)軟骨降解作用和骨吸收功能；RXFP2可能在成骨細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。綜上,RLN能促進(jìn)髁狀突關(guān)節(jié)軟骨的降解和小梁骨的吸收,可能是TMD發(fā)病的重要刺激因素。本研究為深入探討TMJ髁狀突破壞的病理機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和嶄新的研究思路。
【關(guān)鍵詞】：髁狀突 恥骨松弛激素 基質(zhì)金屬蛋白酶 破骨細(xì)胞 RANKL/OPG
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R782.6
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號(hào)說明13-16
• 前言16-21
• 參考文獻(xiàn)19-21
• 第一部分 全身緩釋RLN對(duì)小鼠髁狀突軟骨和骨的影響21-57
• 材料與方法22-38
• 結(jié)果38-49
• 討論49-52
• 總結(jié)52-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 第二部分 MMP9或MMP13基因敲除對(duì)RLN誘導(dǎo)的髁狀突軟骨和骨破壞的影響57-78
• 材料與方法58-59
• 結(jié)果59-70
• 討論70-73
• 總結(jié)73-75
• 參考文獻(xiàn)75-78
• 第三部分 RXFP1和RXFP2受體在RLN誘導(dǎo)的髁狀突軟骨和骨破壞過程中的作用78-100
• 材料與方法79-81
• 結(jié)果81-92
• 討論92-95
• 總結(jié)95-96
• 參考文獻(xiàn)96-100
• 全文總結(jié)100-101
• 致謝101-102
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄102-104
• 附件104-163
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表163

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：597519