本文關(guān)鍵詞：ClC-7引起牙缺失的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在罕見(jiàn)的遺傳性骨病-骨硬化癥病例中,CLCN7基因發(fā)生了突變,患者表現(xiàn)為全身彌漫性骨密度增高,其核心機(jī)制是當(dāng)ClC-7功能障礙時(shí)破骨細(xì)胞不能正常發(fā)揮作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CLC-7蛋白表達(dá)于小鼠胚胎及出生后1天的小鼠牙胚中,并且一些骨硬化癥患者口腔表現(xiàn)為牙齒缺失,未萌出,牙根發(fā)育停止,且有牙釉質(zhì)發(fā)育不全表現(xiàn),Clcn7基因敲除小鼠也表現(xiàn)為牙不萌出。ClC-7功能障礙出現(xiàn)的這些牙異常是由于破骨細(xì)胞異常直接造成的還是由于ClC-7直接參與了牙胚發(fā)育的調(diào)控尚不清楚,本研究擬采用腎被膜移植牙胚的方法,模擬一個(gè)缺乏破骨細(xì)胞的環(huán)境使牙胚在此環(huán)境中的生長(zhǎng),通過(guò)Clcn7 shRNA慢病毒感染、降低牙胚Clcn7基因的表達(dá),從而觀察牙胚生長(zhǎng)的情況。方法:1.Clcn7 shRNA慢病毒的制備及牙胚感染慢病毒體系的建立。取E13.5天Balb/c小鼠的下頜第一磨牙牙胚,用帶GFP綠色熒光的shRNA慢病毒將其感染,連續(xù)4天觀察感染后牙胚熒光表達(dá)情況,以確定最佳的感染復(fù)數(shù)(MOI)。在確定了最佳感染復(fù)數(shù)后,用針對(duì)Clcn7 shRNA慢病毒感染牙胚后,提取牙胚組織RNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證對(duì)Clcn7的基因沉默效果。2.Clcn7基因沉默對(duì)牙形態(tài)的影響。將感染Clcn7 shRNA慢病毒的牙胚移植于同種雄性成年小鼠的腎被膜下,4周后處死宿主小鼠,取出移植塊,進(jìn)行micro-CT掃描,觀察牙齒形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。將牙胚移植塊進(jìn)行石蠟切片、he染色及azon染色,觀察牙齒各個(gè)結(jié)構(gòu)如牙根、牙本質(zhì)、牙周組織等的改變,觀察clcn7對(duì)牙齒發(fā)育的影響。3.clcn7基因沉默對(duì)牙相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。采用免疫組化方法進(jìn)一步研究clc-7及dsp的表達(dá),初步判斷clc-7對(duì)牙發(fā)育影響的可能機(jī)制。另外選取成牙本質(zhì)細(xì)胞mdpc-23細(xì)胞系作為研究對(duì)象,進(jìn)行clcn7sirna轉(zhuǎn)染,提取細(xì)胞mrna,利用實(shí)時(shí)定量pcr實(shí)驗(yàn)觀察clcn7及dspp的表達(dá)情況。結(jié)果:1.clcn7shrna慢病毒對(duì)牙胚的感染復(fù)數(shù)(moi)為5000tu/每個(gè)牙胚,感染時(shí)間為24小時(shí)。在這種條件下,感染效果最好,綠色熒光表達(dá)最強(qiáng)。2.牙胚感染clcn7shrna慢病毒后,用牙胚組織提取rna反轉(zhuǎn)錄得到的cdna做實(shí)時(shí)定量pcr結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組比陰性對(duì)照組clcn7的表達(dá)降低了70%(p0.05)。3.clcn7shrna慢病毒感染牙胚后,將牙胚移植于腎被膜下4周后micro-ct掃描結(jié)果顯示,空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組牙齒發(fā)育完好,結(jié)構(gòu)完整,牙根發(fā)育正常,牙尖輪廓清晰,實(shí)驗(yàn)組牙齒畸形,牙根彎曲或變短,牙尖結(jié)構(gòu)不明顯。4.牙齒石蠟切片he染色及azon染色結(jié)果顯示,空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組牙齒結(jié)構(gòu)完整,前期牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)正常,牙周組織結(jié)構(gòu)正常,其牙周韌帶、牙骨質(zhì)及牙槽骨結(jié)構(gòu)正常、清晰。而實(shí)驗(yàn)組部分前期牙本質(zhì)變寬,牙根彎曲,牙周組織中正常的牙周韌帶、牙骨質(zhì)及牙槽骨消失,充滿了排列紊亂的成纖維細(xì)胞。5.石蠟切片免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,clc-7及dsp表達(dá)于成牙本質(zhì)細(xì)胞及前期牙本質(zhì),與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組clc-7的表達(dá)未見(jiàn)明顯降低,而dsp表達(dá)明顯降低。6.成牙本質(zhì)細(xì)胞mdpc-23細(xì)胞系實(shí)時(shí)定量pcr結(jié)果顯示:與陰性對(duì)照組相比,clcn7sirna實(shí)驗(yàn)組clcn7的表達(dá)明顯降低,而dspp的表達(dá)未發(fā)生改變。結(jié)論:1.無(wú)論是在牙胚組織還是成牙本質(zhì)細(xì)胞mdpc-23細(xì)胞系中,clcn7shrna慢病毒或sirna可有效地沉默clcn7基因,降低clc-7的表達(dá)。2.采用腎被膜下移植牙胚的方法,模擬一個(gè)缺乏破骨細(xì)胞的環(huán)境,使牙胚在此環(huán)境中生長(zhǎng),從而觀察ClC-7在牙齒發(fā)育中所起的作用,同時(shí)也驗(yàn)證了腎被膜下微環(huán)境對(duì)牙齒發(fā)育的可行性,為牙胚的生長(zhǎng)及發(fā)育提供了極好的環(huán)境。3.CLC-7表達(dá)于前期牙本質(zhì)及成牙本質(zhì)細(xì)胞。4.ClC-7在牙胚的發(fā)育中具有重要的作用,可影響牙齒的形態(tài),牙根的發(fā)育,牙本質(zhì)的發(fā)育。ClC-7可能是通過(guò)影響DSP的表達(dá)進(jìn)而影響牙本質(zhì)的發(fā)育,最終影響牙齒的發(fā)育。
【關(guān)鍵詞】：RNA干擾 shRNA ClC-7 牙胚 慢病毒 MDPC-23
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R780.2
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-12
• 文獻(xiàn)回顧12-25
• 實(shí)驗(yàn)一 Clcn7 sh RNA慢病毒的制備及慢病毒感染牙胚實(shí)驗(yàn)體系的建立25-33
• 1 材料與設(shè)備25-26
• 2 實(shí)驗(yàn)方法26-30
• 3 結(jié)果30-32
• 4 討論32-33
• 實(shí)驗(yàn)二 Clcn7基因沉默對(duì)牙形態(tài)的影響33-43
• 1 材料與設(shè)備33-36
• 2 實(shí)驗(yàn)方法36-39
• 3 結(jié)果39-42
• 4 討論42-43
• 實(shí)驗(yàn)三 Clcn7基因沉默對(duì)牙相關(guān)蛋白表達(dá)的影響43-52
• 1 材料與設(shè)備43-44
• 2 實(shí)驗(yàn)方法44-47
• 3 結(jié)果47-50
• 4 討論50-52
• 小結(jié)52-54
• 參考文獻(xiàn)54-67
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果67-68
• 致謝68

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：481911