本文關鍵詞：ClC-7引起牙缺失的動物實驗研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在罕見的遺傳性骨病-骨硬化癥病例中,CLCN7基因發(fā)生了突變,患者表現(xiàn)為全身彌漫性骨密度增高,其核心機制是當ClC-7功能障礙時破骨細胞不能正常發(fā)揮作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CLC-7蛋白表達于小鼠胚胎及出生后1天的小鼠牙胚中,并且一些骨硬化癥患者口腔表現(xiàn)為牙齒缺失,未萌出,牙根發(fā)育停止,且有牙釉質發(fā)育不全表現(xiàn),Clcn7基因敲除小鼠也表現(xiàn)為牙不萌出。ClC-7功能障礙出現(xiàn)的這些牙異常是由于破骨細胞異常直接造成的還是由于ClC-7直接參與了牙胚發(fā)育的調控尚不清楚,本研究擬采用腎被膜移植牙胚的方法,模擬一個缺乏破骨細胞的環(huán)境使牙胚在此環(huán)境中的生長,通過Clcn7 shRNA慢病毒感染、降低牙胚Clcn7基因的表達,從而觀察牙胚生長的情況。方法:1.Clcn7 shRNA慢病毒的制備及牙胚感染慢病毒體系的建立。取E13.5天Balb/c小鼠的下頜第一磨牙牙胚,用帶GFP綠色熒光的shRNA慢病毒將其感染,連續(xù)4天觀察感染后牙胚熒光表達情況,以確定最佳的感染復數(shù)(MOI)。在確定了最佳感染復數(shù)后,用針對Clcn7 shRNA慢病毒感染牙胚后,提取牙胚組織RNA,進行實時定量PCR實驗,驗證對Clcn7的基因沉默效果。2.Clcn7基因沉默對牙形態(tài)的影響。將感染Clcn7 shRNA慢病毒的牙胚移植于同種雄性成年小鼠的腎被膜下,4周后處死宿主小鼠,取出移植塊,進行micro-CT掃描,觀察牙齒形態(tài)結構的變化。將牙胚移植塊進行石蠟切片、he染色及azon染色,觀察牙齒各個結構如牙根、牙本質、牙周組織等的改變,觀察clcn7對牙齒發(fā)育的影響。3.clcn7基因沉默對牙相關蛋白表達的影響。采用免疫組化方法進一步研究clc-7及dsp的表達,初步判斷clc-7對牙發(fā)育影響的可能機制。另外選取成牙本質細胞mdpc-23細胞系作為研究對象,進行clcn7sirna轉染,提取細胞mrna,利用實時定量pcr實驗觀察clcn7及dspp的表達情況。結果:1.clcn7shrna慢病毒對牙胚的感染復數(shù)(moi)為5000tu/每個牙胚,感染時間為24小時。在這種條件下,感染效果最好,綠色熒光表達最強。2.牙胚感染clcn7shrna慢病毒后,用牙胚組織提取rna反轉錄得到的cdna做實時定量pcr結果顯示,實驗組比陰性對照組clcn7的表達降低了70%(p0.05)。3.clcn7shrna慢病毒感染牙胚后,將牙胚移植于腎被膜下4周后micro-ct掃描結果顯示,空白對照組及陰性對照組牙齒發(fā)育完好,結構完整,牙根發(fā)育正常,牙尖輪廓清晰,實驗組牙齒畸形,牙根彎曲或變短,牙尖結構不明顯。4.牙齒石蠟切片he染色及azon染色結果顯示,空白對照組及陰性對照組牙齒結構完整,前期牙本質結構正常,牙周組織結構正常,其牙周韌帶、牙骨質及牙槽骨結構正常、清晰。而實驗組部分前期牙本質變寬,牙根彎曲,牙周組織中正常的牙周韌帶、牙骨質及牙槽骨消失,充滿了排列紊亂的成纖維細胞。5.石蠟切片免疫組織化學染色結果顯示,clc-7及dsp表達于成牙本質細胞及前期牙本質,與空白對照組及陰性對照組相比,實驗組clc-7的表達未見明顯降低,而dsp表達明顯降低。6.成牙本質細胞mdpc-23細胞系實時定量pcr結果顯示:與陰性對照組相比,clcn7sirna實驗組clcn7的表達明顯降低,而dspp的表達未發(fā)生改變。結論:1.無論是在牙胚組織還是成牙本質細胞mdpc-23細胞系中,clcn7shrna慢病毒或sirna可有效地沉默clcn7基因,降低clc-7的表達。2.采用腎被膜下移植牙胚的方法,模擬一個缺乏破骨細胞的環(huán)境,使牙胚在此環(huán)境中生長,從而觀察ClC-7在牙齒發(fā)育中所起的作用,同時也驗證了腎被膜下微環(huán)境對牙齒發(fā)育的可行性,為牙胚的生長及發(fā)育提供了極好的環(huán)境。3.CLC-7表達于前期牙本質及成牙本質細胞。4.ClC-7在牙胚的發(fā)育中具有重要的作用,可影響牙齒的形態(tài),牙根的發(fā)育,牙本質的發(fā)育。ClC-7可能是通過影響DSP的表達進而影響牙本質的發(fā)育,最終影響牙齒的發(fā)育。
【關鍵詞】：RNA干擾 shRNA ClC-7 牙胚 慢病毒 MDPC-23
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R780.2
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-12
• 文獻回顧12-25
• 實驗一 Clcn7 sh RNA慢病毒的制備及慢病毒感染牙胚實驗體系的建立25-33
• 1 材料與設備25-26
• 2 實驗方法26-30
• 3 結果30-32
• 4 討論32-33
• 實驗二 Clcn7基因沉默對牙形態(tài)的影響33-43
• 1 材料與設備33-36
• 2 實驗方法36-39
• 3 結果39-42
• 4 討論42-43
• 實驗三 Clcn7基因沉默對牙相關蛋白表達的影響43-52
• 1 材料與設備43-44
• 2 實驗方法44-47
• 3 結果47-50
• 4 討論50-52
• 小結52-54
• 參考文獻54-67
• 個人簡歷和研究成果67-68
• 致謝68

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1 楊帆,肖明振,趙守亮;人牙胚成纖維細胞生長因子18的基因克隆和序列分析[J];牙體牙髓牙周病學雜志;2003年05期

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6 于金華,金巖,史俊南,聶鑫,王亦菁,莊Y

本文編號：481911