利用BiFC技術(shù)研究p12 CDK2AP1 和Upp的相互作用及Upp外源表達(dá)對(duì)SCC-25細(xì)胞的影響
發(fā)布時(shí)間：2020-12-20 03:32
口腔癌是位居世界第六位的常見癌，組織病理學(xué)研究表明其大部分屬于鱗狀上皮細(xì)胞癌。由于發(fā)病部位在頭頸，病損多表淺，嚴(yán)重影響了患者的生理功能和心理健康。隨著分子生物學(xué)等領(lǐng)域的不斷發(fā)展針對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制、癌基因、抑癌基因的研究成為近年來(lái)腫瘤基因治療的主要研究方向之一。CDK2AP1（cyclin dependent kinase2associated protein1）作為抑癌基因中的一員，越來(lái)越被研究者所關(guān)注。其調(diào)控蛋白p12CDK2AP1也受到廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)p12CDK2AP1蛋白負(fù)性調(diào)節(jié)CDK2（cyclin dependentkinase2）的活性從而達(dá)到抑制DNA復(fù)制的作用，其在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中低表達(dá)或缺失表達(dá)，說(shuō)明p12CDK2AP1蛋白可能在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用。2009年我們利用酵母雙雜交篩選出了p12CDK2AP1蛋白的新的結(jié)合作用蛋白Upp（unnamed proteinproduct），被定位于人類4號(hào)染色體，與致死因子4，MORF4（mortal...
【文章來(lái)源】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)陜西省 211工程院校
【文章頁(yè)數(shù)】：71 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
酵母雙雜交技術(shù)原理示意圖
?妒墾?宦畚?16-圖 2 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)原理示意圖2.2 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)的特點(diǎn)顯微成像技術(shù)和 FRET 的聯(lián)用，使蛋白質(zhì)相互作用的研究更準(zhǔn)確，實(shí)時(shí)[89]。但FRET 技術(shù)仍存在難以解決的難題：(1)自發(fā)熒光的細(xì)胞，供體和受體發(fā)射光譜有重疊，同時(shí)被激發(fā)等。(2)FRET 技術(shù)對(duì)設(shè)備要求較高。(3)FRET 數(shù)據(jù)處理較為繁瑣。3 生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)技術(shù)3.1 生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)技術(shù)原理生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移 BRET(Bioluminescence resonance energy transfer)技術(shù)的能量轉(zhuǎn)移原理和 FRET 相同[90, 91]。BRET 是將某些海生動(dòng)物體內(nèi)天然的熒光素酶作為能量供體，和相應(yīng)底物的作用才能激發(fā)出熒光，能量受體是一個(gè)熒光蛋白，當(dāng)供體熒光素酶的激發(fā)光和受體熒光蛋白的吸收光光譜有重疊時(shí)，能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。在蛋白質(zhì)相互作用的研究中，需將一個(gè)蛋白與能量供體融合，另一蛋白與能量受體融合，如果兩蛋白質(zhì)之間沒有相互作用，只能檢測(cè)到能量供體氧化底物后發(fā)出的光。當(dāng)兩蛋白質(zhì)之間有相互作用時(shí)，由于兩蛋白在空間上相互靠近，使能量供受體之間的距離靠近，當(dāng)供受體距離小于 10nm 時(shí)，會(huì)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，受體會(huì)發(fā)光，可檢測(cè)到其光信號(hào)[92]。3.2 生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)技術(shù)的特點(diǎn)BRET 最大的優(yōu)勢(shì)是能在活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的觀察蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用
圖 3 雙分子熒光互補(bǔ)原理[99]2. 雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)的提出蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)技術(shù)是 BiFC 技術(shù)的基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)技術(shù)中功能蛋白重新整合，蛋白活性恢復(fù)，還需通過(guò)特定底物變化來(lái)測(cè)定蛋白活性的恢復(fù)情況，BiFC 技術(shù)中斷裂熒光片段重新整合成完整的熒光蛋白，利用熒光蛋白的發(fā)光特性，自身可以直接作為報(bào)告基因，比蛋白質(zhì)互補(bǔ)技術(shù)更加直觀方便了[99]。完整的綠色熒光蛋白 GFP(green fluorescent protein，GFP)氨基酸序列常作為熒光標(biāo)記，1998 年 Abide 等[100]首次嘗試了將目的短肽插入到 GFP 的某些氨基酸位點(diǎn)來(lái)檢測(cè)是否能重新發(fā)射熒光，以此來(lái)篩選合適的插入位點(diǎn)。1999 年 Baird 等[101]在以一次實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)在 GFP 的一個(gè)突變體的 Y145 位點(diǎn)插入 6 個(gè)氨基酸殘基(FKTRHN)，GFP 仍能發(fā)射熒光，說(shuō)明外源片段插入 GFP 的某些位點(diǎn)時(shí)不會(huì)引起其三維結(jié)構(gòu)的變化，也不影響其發(fā)色團(tuán)。他們隨即進(jìn)行了 GFP 的一個(gè)循環(huán)排列實(shí)驗(yàn)，來(lái)篩選還有哪些位點(diǎn)可以插入外源片段。Ghosh 等[98]于 2000 年首次報(bào)道了 1 個(gè)借助反向平行的亮氨酸拉
本文編號(hào)：2927129
【文章來(lái)源】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)陜西省 211工程院校
【文章頁(yè)數(shù)】：71 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
酵母雙雜交技術(shù)原理示意圖
?妒墾?宦畚?16-圖 2 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)原理示意圖2.2 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)的特點(diǎn)顯微成像技術(shù)和 FRET 的聯(lián)用，使蛋白質(zhì)相互作用的研究更準(zhǔn)確，實(shí)時(shí)[89]。但FRET 技術(shù)仍存在難以解決的難題：(1)自發(fā)熒光的細(xì)胞，供體和受體發(fā)射光譜有重疊，同時(shí)被激發(fā)等。(2)FRET 技術(shù)對(duì)設(shè)備要求較高。(3)FRET 數(shù)據(jù)處理較為繁瑣。3 生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)技術(shù)3.1 生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)技術(shù)原理生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移 BRET(Bioluminescence resonance energy transfer)技術(shù)的能量轉(zhuǎn)移原理和 FRET 相同[90, 91]。BRET 是將某些海生動(dòng)物體內(nèi)天然的熒光素酶作為能量供體，和相應(yīng)底物的作用才能激發(fā)出熒光，能量受體是一個(gè)熒光蛋白，當(dāng)供體熒光素酶的激發(fā)光和受體熒光蛋白的吸收光光譜有重疊時(shí)，能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。在蛋白質(zhì)相互作用的研究中，需將一個(gè)蛋白與能量供體融合，另一蛋白與能量受體融合，如果兩蛋白質(zhì)之間沒有相互作用，只能檢測(cè)到能量供體氧化底物后發(fā)出的光。當(dāng)兩蛋白質(zhì)之間有相互作用時(shí)，由于兩蛋白在空間上相互靠近，使能量供受體之間的距離靠近，當(dāng)供受體距離小于 10nm 時(shí)，會(huì)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，受體會(huì)發(fā)光，可檢測(cè)到其光信號(hào)[92]。3.2 生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)技術(shù)的特點(diǎn)BRET 最大的優(yōu)勢(shì)是能在活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的觀察蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用
圖 3 雙分子熒光互補(bǔ)原理[99]2. 雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)的提出蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)技術(shù)是 BiFC 技術(shù)的基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)技術(shù)中功能蛋白重新整合，蛋白活性恢復(fù)，還需通過(guò)特定底物變化來(lái)測(cè)定蛋白活性的恢復(fù)情況，BiFC 技術(shù)中斷裂熒光片段重新整合成完整的熒光蛋白，利用熒光蛋白的發(fā)光特性，自身可以直接作為報(bào)告基因，比蛋白質(zhì)互補(bǔ)技術(shù)更加直觀方便了[99]。完整的綠色熒光蛋白 GFP(green fluorescent protein，GFP)氨基酸序列常作為熒光標(biāo)記，1998 年 Abide 等[100]首次嘗試了將目的短肽插入到 GFP 的某些氨基酸位點(diǎn)來(lái)檢測(cè)是否能重新發(fā)射熒光，以此來(lái)篩選合適的插入位點(diǎn)。1999 年 Baird 等[101]在以一次實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)在 GFP 的一個(gè)突變體的 Y145 位點(diǎn)插入 6 個(gè)氨基酸殘基(FKTRHN)，GFP 仍能發(fā)射熒光，說(shuō)明外源片段插入 GFP 的某些位點(diǎn)時(shí)不會(huì)引起其三維結(jié)構(gòu)的變化，也不影響其發(fā)色團(tuán)。他們隨即進(jìn)行了 GFP 的一個(gè)循環(huán)排列實(shí)驗(yàn)，來(lái)篩選還有哪些位點(diǎn)可以插入外源片段。Ghosh 等[98]于 2000 年首次報(bào)道了 1 個(gè)借助反向平行的亮氨酸拉
本文編號(hào)：2927129
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