本文關(guān)鍵詞：MicroRNA靶向Id1對BMSCs成骨分化的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《山東大學(xué)》 2015年

MicroRNA靶向Id1對BMSCs成骨分化的影響

聶曉萌  

【摘要】：[研究背景]骨形成蛋白2 (Bone morphogenetic protein, BMP2)基因可促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs)的成骨分化,但在成骨分化的終末期該基因可引起B(yǎng)MSCs成骨指標(biāo)不佳。Idl因子在BMSCs成骨分化過程中的表達(dá)變化,是BMSCs成骨分化的關(guān)鍵。BMP2上調(diào)工d1因子的表達(dá),提示Idl因子可能是BMP2高表達(dá)環(huán)境中BMSCs成骨分化的關(guān)鍵因子。通過miRNA芯片篩選發(fā)現(xiàn)某些miRNA表達(dá)水平在BMP2刺激和未刺激的BMSCs中存在顯著差異,并且這些miRNA與通過生物信息學(xué)預(yù)測的可能調(diào)控Idl因子表達(dá)的miRNA相符合。[目的]闡述體外高表達(dá)BMP2及Idl因子的變化對大鼠BMSCs成骨分化的影響,驗證Idl因子在BMP2修飾的BMSCs成骨分化中的重要作用,證明Id表達(dá)上調(diào)是BMP2抑制BMSCs成骨分化的原因并探尋BMP2對Idl的調(diào)控機(jī)制；擬篩選鑒定出靶向作用于Idl因子的miRNA分子,證明某些特定的miRNA表達(dá)變化可能是BMP2上調(diào)Idl表達(dá)的新分子機(jī)制,為頜面部骨缺損修復(fù)提供新的研究策略。[方法]1、分離及純化培養(yǎng)Wistar大鼠的BMSCs,分別于不同時間點,顯微鏡下觀察BMSCs的形態(tài)；取第3-5代BMSCs,進(jìn)行成骨誘導(dǎo),培養(yǎng)7-14天,進(jìn)行茜素紅染色,光學(xué)顯微鏡下觀察礦化情況,進(jìn)行成骨鑒定；取第3-5代BMSCs,進(jìn)行成脂誘導(dǎo),培養(yǎng)7-14天,進(jìn)行油紅0染色,光學(xué)顯微鏡觀察著色脂滴,進(jìn)行成脂鑒定。2、根據(jù)Genbank中Idl的mRNA序列設(shè)計合成引物,PCR擴(kuò)增基因片段并鑒定PCR產(chǎn)物；對已構(gòu)建的pDC316-BMP2-GFP重組腺病毒,進(jìn)行滴度測定；腺病毒Ad-BMP2、Ad-GFP轉(zhuǎn)染第2-3代BMSCs,病毒轉(zhuǎn)染后繪制細(xì)胞生長曲線,檢測病毒對細(xì)胞生長增殖的影響；取MOI值為40時,腺病毒Ad-BMP2、Ad-GFP轉(zhuǎn)染第2-3代BMSCs,分別于不同時間點收集細(xì)胞(Ad-BMP2-BMSCs組、Ad-GFP-BMSCs組、BMSCs組),實時定量PCR檢測細(xì)胞中目的基因Idl的表達(dá)。3、篩選靶向Idl基因的miRNA,應(yīng)用miRNA在線數(shù)據(jù)庫,針對Idl因子預(yù)測可能調(diào)控其表達(dá)的miRNA分子,根據(jù)評分結(jié)果加以選擇,通過miRNA表達(dá)譜芯片及相關(guān)技術(shù)篩選,將芯片篩選和預(yù)測的結(jié)果進(jìn)行分析,提取細(xì)胞的RNA,應(yīng)用Real-time PCR方法檢測驗證miRNA的變化與芯片檢測結(jié)果的一致性,篩選從而明確研究的miRNA。[結(jié)果]1、成骨誘導(dǎo)的BMSCs生長相對緩慢,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,呈現(xiàn)多角形成骨細(xì)胞形態(tài)；誘導(dǎo)7天后,茜素紅染色可觀察到少量點狀紅色礦化結(jié)節(jié)的形成,誘導(dǎo)14天可觀察到明顯的礦化結(jié)節(jié)。2、脂肪誘導(dǎo)液誘導(dǎo)BMSCs,誘導(dǎo)后的細(xì)胞增殖稍緩慢,細(xì)胞形態(tài)相對展平；誘導(dǎo)14天后油紅O染色可觀察到脂滴形成。3、Ad-BMP2轉(zhuǎn)染BMSCs48h后,熒光顯微鏡現(xiàn)觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)的情況,細(xì)胞表達(dá)綠色熒光比例隨MOI值的增加而增高,當(dāng)MOI值為40時,在熒光顯微鏡下觀察有95%以上的細(xì)胞出現(xiàn)了綠色熒光。4、腺病毒轉(zhuǎn)染后沒有影響細(xì)胞的增殖,各組增殖數(shù)目間無顯著差異(P0.05)。5、通過miRNA表達(dá)譜芯片及相關(guān)技術(shù)篩選其差異情況發(fā)現(xiàn)有123個miRNA下調(diào),114個miRNA上調(diào)；將芯片篩選和預(yù)測的結(jié)果進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)一共有3個miRNA發(fā)生變化,miRNA-338、miRNA-195及miRNA-98;其中1個上調(diào),2個下調(diào)。[結(jié)論]1、密度梯度離心法分離大鼠骨髓單個核細(xì)胞,此方法可得到純度較好的BMSCs,BMSCs具有成骨分化能力和成脂肪分化能力。2、Ad-BMP2重組腺病毒表達(dá)載體,滴度高轉(zhuǎn)染效率好,為穩(wěn)定且有效的基因表達(dá)載體,病毒轉(zhuǎn)染后可使BMSCs過表達(dá)BMP2,最佳MOI值為40。3、在靶向Idl的miRNA分子中,生物預(yù)測結(jié)果與芯片檢測結(jié)果一致的是：miRNA-338上調(diào)、miRNA-195及miRNA-98下調(diào)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R78
【目錄】：

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