科學(xué)研究表明,阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease, AD)的主要病理特征是細胞外老年斑的形成和細胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)的集聚,而老年斑的主要組成成分β-淀粉樣蛋白42 (P-amyloid peptide, Aβ1-42)具神經(jīng)元毒性,是AD的主要致病原因。神經(jīng)干細胞(Neural Stem Cells, NSCs)是一類能自我復(fù)制,具有多向分化潛能細胞。神經(jīng)干細胞的體外分離、體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化到移植治療,為神經(jīng)系統(tǒng)損傷、神經(jīng)退行性病變的治療提供了有效的途徑。鑒于此,本研究圍繞Aβ1-42對細胞(人神經(jīng)干細胞和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞)研究進行了如下工作。 利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了畢赤酵母真核表達載體pPICZaC-hAβ1-42>電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33,篩選出能夠穩(wěn)定高效分泌表達重組人Aβ1-42 (rhAβ1-42)的工程菌。重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE、Western Blotting、ELISA分析,證明表達的rhAβ1-42具有生物學(xué)活性。對rhAβ1-42進行5L搖瓶水平發(fā)酵,并對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化,rhAβ1-42表達量達到210mg·L-1。建立了一種分離...

【文章頁數(shù)】：127 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
內(nèi)容提要
中文摘要
Abstract
第1章 文獻回顧
    第1節(jié) Aβ蛋白概述
        1.1 Aβ蛋白的來源和分類
        1.2 Aβ蛋白的分子結(jié)構(gòu)
        1.3 Aβ蛋白與阿爾茲海默病
        1.4 Aβ蛋白的制備
    第2節(jié) 神經(jīng)干細胞的研究進展
        2.1 神經(jīng)干細胞的概念
        2.2 神經(jīng)干細胞的來源與特性
        2.3 體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的應(yīng)用
        2.4 轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞在腦及脊髓損傷中的作用
        2.5 神經(jīng)干細胞研究的前景及展望
第2章 rhAβ_1-42在畢赤酵母中的高效分泌表達及純化工藝
    2.1 材料與方法
        2.1.1 器材及設(shè)備
        2.1.2 主要試劑及配制
        2.1.3 溶液配制
        2.1.4 質(zhì)粒與菌株
        2.1.5 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化
        2.1.6 陽性菌株的篩選
        2.1.7 表達產(chǎn)物rhAβ_1-42分析
        2.1.8 確定畢赤酵母表達rhAβ_1-42的最佳pH值
        2.1.9 rhAβ_1-42的搖瓶水平發(fā)酵表達
        2.1.10 rhAβ_1-42的小量純化
        2.1.11 rhAβ_1-42的分析鑒定
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 PCR方法篩選rhAβ_1-42轉(zhuǎn)化陽性菌株
        2.2.2 Tricine-SDS-PAGE篩選rhAβ_1-42表達的高峰時間
        2.2.3 SDS-PAGE篩選高表達rhAβ_1-42的工程菌
        2.2.4 畢赤酵母表達rhAβ_1-42最佳pH值的確定
    2.3 rhAβ_1-42的小量純化
        2.3.1 硫酸銨分級沉淀
        2.3.2 透析
        2.3.3 AKTA Explorer中壓層析系統(tǒng)純化
        2.3.4 Tricine-SDS-PAGE和Western blotting分析純化rhAβ1-42

    2.4 討論
第3章 rhAβ_1-42促進人神經(jīng)干細胞凋亡作用的研究
    3.1 材料和方法
        3.1.1 器材及設(shè)備
        3.1.2 主要試劑及配制
        3.1.3 溶液配制
        3.1.4 Aβ_1-42寡聚體的制備
        3.1.5 神經(jīng)干細胞和皮膚成纖維細胞的原代培養(yǎng)
        3.1.6 神經(jīng)干細胞的鑒定
        3.1.7 形態(tài)學(xué)特征觀察
        3.1.8 rhAβ_1-42對神經(jīng)干細胞生長作用的檢測
        3.1.9 流式細胞術(shù)檢測rhAβ_1-42對神經(jīng)干細胞凋亡率的影響
        3.1.10 rhAβ_1-42致人神經(jīng)干細胞的神經(jīng)發(fā)生效應(yīng)
        3.1.11 DNA瓊脂糖凝膠電泳
        3.1.12 超微結(jié)構(gòu)分析
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 神經(jīng)干細胞和皮膚成纖維細胞的分離、培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察
        3.2.2 神經(jīng)干細胞的鑒定
        3.2.3 rhAβ_1-42對神經(jīng)干細胞形態(tài)的影響
        3.2.4 rhAβ_1-42對神經(jīng)干細胞生長作用的檢測
        3.2.5 rhAβ_1-42對人皮膚成纖維細胞的作用
        3.2.6 rhAβ_1-42對神經(jīng)干細胞凋亡率的影響
        3.2.7 DNA瓊脂糖凝膠電泳
        3.2.8 透射電子顯微鏡下觀察對神經(jīng)干細胞超微結(jié)構(gòu)的影響
        3.2.9 神經(jīng)發(fā)生效應(yīng)
    3.3 討論
第4章 rhAβ_1-42促進人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞凋亡作用的研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 器材及設(shè)備
        4.1.2 主要試劑及配制
        4.1.3 溶液配制
        4.1.4 細胞培養(yǎng)
        4.1.5 細胞體外增殖能力測定
        4.1.6 細胞形態(tài)學(xué)觀察
        4.1.7 AO/EB觀察細胞形態(tài)學(xué)改變
        4.1.8 流式細胞術(shù)檢測rhAβ_1-42對U251細胞的凋亡作用
        4.1.9 Western blotting
        4.1.10 統(tǒng)計學(xué)方法
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 rhAβ_1-42對U251細胞增殖能力的影響
        4.2.2 倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化
        4.2.3 AO/EB雙染法觀察細胞凋亡形態(tài)學(xué)改變
        4.2.4 流式細胞術(shù)分析rhAβ_1-42對U251細胞的凋亡影響
        4.2.5 Western blotting檢測不同濃度rhAβ_1-42對U251細胞凋亡蛋白bax,bcl-2的表達情況
    4.3 討論
研究總結(jié)
參考文獻
攻讀博士期間所取得科研成果
致謝



本文編號：3964469

boshi