目的:(1)探索突破血腦屏障的新型給藥系統(tǒng),促進(jìn)藥物進(jìn)入腦內(nèi),提高局部藥物濃度,為阿爾茨海默病(Alzheimer,AD)等大腦中樞神經(jīng)退行性病變的臨床治療手段提供新策略;(2)考察脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154在APP/PS1小鼠AD模型中的治療作用,同時以ADAM10為靶點(diǎn)在體外深入探討Tat-haFGF_14-154神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制,為Tat-haFGF_14-154應(yīng)用于AD等神經(jīng)退行性疾病的治療提供藥理學(xué)基礎(chǔ)和依據(jù)。方法:(1)根據(jù)ELISA法檢測的脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154包封率確定脂質(zhì)體藥物制備的最佳條件,并用考馬斯亮藍(lán)染色檢測脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154的聚合情況。(2)通過鼻腔滴注的給藥方式將脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154遞送到正常小鼠腦內(nèi),Western blotting檢測a FGF在嗅球和皮質(zhì)的分布情況。(3)采用APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠為AD模型動物,AD鼻腔滴注脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-...

【文章頁數(shù)】：120 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 前言
    1.1 阿爾茨海默病
        1.1.1 AD概述
        1.1.2 AD的發(fā)病機(jī)制
            1.1.2.1 發(fā)病機(jī)制假說
            1.1.2.2 Aβ 代謝相關(guān)蛋白與AD
        1.1.3 AD的治療現(xiàn)狀
            1.1.3.1 神經(jīng)遞質(zhì)替代療法
            1.1.3.2 以Aβ 級聯(lián)假說為基礎(chǔ)的治療
            1.1.3.3 抗炎癥和氧化應(yīng)激為基礎(chǔ)的治療
    1.2 酸性成纖維細(xì)胞生長因子
        1.2.1 aFGF概述
        1.2.2 aFGF的功能區(qū)與生物學(xué)功能
        1.2.3 aFGF的信號通路和作用機(jī)制
            1.2.3.1 PI3K信號通路
            1.2.3.2 MAPK信號通路
            1.2.3.3 PLCγ 信號通路
        1.2.4 aFGF在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究進(jìn)展
    1.3 提高大分子蛋白藥物穿透血腦屏障的方法
        1.3.1 Tat-PTD蛋白融合技術(shù)
        1.3.2 鼻腔滴注的給藥方式
        1.3.3 脂質(zhì)體載體藥物遞送系統(tǒng)
    1.4 課題思路與研究內(nèi)容
        1.4.1 脂質(zhì)體載體、Tat-PTD蛋白融合、鼻腔滴注聯(lián)合給藥系統(tǒng)及其藥效學(xué)評價
        1.4.2 Tat-haFGF_14-154 對AD治療作用的機(jī)制研究
    1.5 技術(shù)路線圖
第二章 鼻腔滴注脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154 對APP/PS1小鼠阿爾茨海默癥狀的改善作用及初步機(jī)制研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料
        2.1.1 主要儀器與設(shè)備
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與材料
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)動物
        2.1.4 主要抗體
        2.1.5 PCR引物
        2.1.6 主要溶液配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154的制備和條件優(yōu)化
            2.2.1.1 脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154的制備
            2.2.1.2 脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154包封率的測定
            2.2.1.3 考馬斯亮藍(lán)染色
        2.2.2 鼻腔滴注脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154在正常小鼠腦內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)
            2.2.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥
            2.2.2.2 動物取材及樣本處理
            2.2.2.3 Western blotting檢測脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154在小鼠嗅球和額前皮質(zhì)的分布
        2.2.3 鼻腔滴注脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154的藥效學(xué)評價
            2.2.3.1 APP/PS1小鼠的基因鑒定
            2.2.3.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥
            2.2.3.3 行為學(xué)檢測
            2.2.3.4 動物取材及樣本處理
            2.2.3.5 小鼠大腦HE染色
            2.2.3.6 免疫組化檢測
            2.2.3.7 Western blotting檢測
            2.2.3.8 酶活檢測
    2.3 數(shù)據(jù)分析
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析
        2.4.1 脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154 制備條件的優(yōu)化
            2.4.1.1 脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154包封率的檢測
            2.4.1.2 考馬斯亮藍(lán)染色檢測脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154的聚集
        2.4.2 鼻腔滴注脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154在正常小鼠嗅球和額前皮質(zhì)的分布
        2.4.3 鼻腔滴注脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154 對APP/PS1小鼠阿爾茨海默癥狀的改善作用
            2.4.3.1 APP/PS1小鼠基因型鑒定
            2.4.3.2 小鼠體重變化
            2.4.3.3 小鼠大腦HE染色結(jié)果
            2.4.3.4 認(rèn)知行為學(xué)實(shí)驗(yàn)—水迷宮實(shí)驗(yàn)
            2.4.3.5 非認(rèn)知行為學(xué)實(shí)驗(yàn)
            2.4.3.6 鼻腔滴注脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154 降低AD小鼠腦內(nèi)Aβ 沉積
            2.4.3.7 鼻腔滴注脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154提高小鼠腦內(nèi)突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)
        2.4.4 鼻腔滴注脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154 改善APP/PS1小鼠阿爾茨海默癥狀的初步作用機(jī)制研究
            2.4.4.1 Tat-haFGF_14-154 對APP剪切相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用
            2.4.4.2 Tat-haFGF_14-154 對ADAM10和BACE1酶活性的調(diào)控作用
            2.4.4.3 Tat-haFGF_14-154 對Aβ 降解蛋白的調(diào)節(jié)作用
    2.5 本章小結(jié)
第三章 Tat-haFGF_14-154 對Aβ_1-42損傷的大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        3.1.1 主要儀器與設(shè)備
        3.1.2 主要試劑與材料
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)動物
        3.1.4 主要抗體
        3.1.5 q-PCR引物
        3.1.6 siRNA序列
        3.1.7 抑制劑信息
        3.1.8 主要溶液配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元提取
        3.2.2 細(xì)胞給藥處理及培養(yǎng)
        3.2.3 MTT細(xì)胞活力檢測
        3.2.4 掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞表面形態(tài)
        3.2.5 細(xì)胞免疫熒光染色
        3.2.6 Western blotting檢測蛋白表達(dá)
        3.2.7 酶活檢測
        3.2.8 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)
        3.2.9 siRNA干擾實(shí)驗(yàn)
    3.3 數(shù)據(jù)分析
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元AD細(xì)胞模型的建立
        3.4.2 Tat-haFGF_14-154 提高Aβ_1-42損傷的大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元活力
        3.4.3 Tat-haFGF_14-154 維持Aβ_1-42損傷的大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的完整性
        3.4.4 Tat-haFGF_14-154 促進(jìn)原代神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)
        3.4.5 Tat-haFGF_14-154 降低原代神經(jīng)元內(nèi)Aβ 的沉積
        3.4.6 Tat-haFGF_14-154 對原代神經(jīng)元Aβ 代謝相關(guān)蛋白的調(diào)控
            3.4.6.1 Tat-haFGF_14-154 對原代神經(jīng)元APP剪切相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)控
            3.4.6.2 Tat-haFGF_14-154 對原代神經(jīng)元ADAM10和BACE1酶活性的調(diào)控作用
            3.4.6.3 Tat-haFGF_14-154 對原代神經(jīng)元APP剪切產(chǎn)物sAPPα 和sAPPβ 生成的影響
            3.4.6.4 Tat-haFGF_14-154 對原代神經(jīng)元Aβ 降解酶的表達(dá)調(diào)控
        3.4.7 siRNA沉默ADAM10的表達(dá)阻斷Tat-haFGF_14-154對Aβ 損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用
            3.4.7.1 siRNA干擾降低ADAM10的表達(dá)
            3.4.7.2 siRNA-ADAM10阻斷了Tat-ha FGF14-154的神經(jīng)保護(hù)作用
        3.4.8 Tat-haFGF_14-154 調(diào)控ADAM10表達(dá)的信號通路研究
            3.4.8.1 體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Tat-haFGF_14-154激活XBP1通路
            3.4.8.2 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)Tat-haFGF_14-154激活PI3K-CREB-IRE1α/XBP1通路
        3.4.9 Tat-haFGF_14-154 通過PI3K-CREB-IRE1α/XBP1通路上調(diào)ADAM10的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用
    3.5 本章小結(jié)
第四章 討論
    4.1 鼻腔滴注脂質(zhì)體Tat-haFGF_14-154的新型給藥方式
    4.2 Tat-haFGF_14-154 改善APP/PS1小鼠阿爾茨海默癥狀并拮抗Aβ 引起的原代皮質(zhì)神經(jīng)元損傷
    4.3 ADAM10介導(dǎo)Tat-haFGF_14-154 發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用
    4.4 Tat-haFGF_14-154 通過激活PI3K-CREB-IRE1α/XBP1通路上調(diào)ADAM10的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用
第五章 結(jié)論與展望
    5.1 全文總結(jié)
    5.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    5.3 前景與展望
參考文獻(xiàn)
英文縮略詞匯總
攻讀博士期間科研情況
課題資助及基金支持
致謝



本文編號：3876148