阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)是老年人最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。1907年由德國精神科醫(yī)生Alois Alzheimer首先提出并以他的名字命名。臨床表現(xiàn)為隱襲起病,逐漸出現(xiàn)記憶力減退、認知功能障礙、行為異常和社交障礙。病情呈進行性加重,逐漸喪失獨立生活能力,發(fā)病后10-20年因并發(fā)癥而死亡。AD可分為家族性(FAD)和散發(fā)性或遲發(fā)性(SAD/LOAD).主要三大病理變化是神經(jīng)細胞外老年斑沉積、神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元缺失等。阿爾茨海默病的發(fā)病機制尚未完全明確。四個突變基因在AD中起重要作用,APP、PS1、PS2家族性AD中發(fā)現(xiàn)的3個基因,及一個在散發(fā)性AD中的危險因素基因ApoE。目前,雖然在基因水平對家族性阿爾茨海默病已經(jīng)有了深入地了解。但是,我們對AD從基因突變到Aβ沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、神經(jīng)元丟失、神經(jīng)突觸可塑性改變、記憶學習能力缺失等病理發(fā)生機制并不了解。Aβ、Tau、PS和ApoE等均在AD的發(fā)病過程中起到重要作用,但以上述幾個方面做為靶點的治療未能取得令人滿意的效果。因此,從新的角度來研究AD的發(fā)病機制,從而為其治療提供新的思路是十...

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【學位級別】：博士

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中文摘要
ABSTRACT
前言
    阿爾茨海默病研究進展
        β淀粉樣蛋白學說
        AD相關(guān)基因?qū)W說
        膽固醇代謝與Aβ蛋白、PS
    microRNA研究進展
        microRNA與標靶
        microRNA的預(yù)測
        microRNA與疾病
        microRNA與神經(jīng)系統(tǒng)
第一部分 APPswe/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠模型分析
    (一) 材料
        1 實驗動物
        2 主要生化試劑
        3 主要儀器設(shè)備
        4 主要溶液配置
    (二) 實驗方法
        1 動物分組及實驗設(shè)計
        2 轉(zhuǎn)基因陽性鼠的PCR鼠尾鑒定
    (三) 實驗結(jié)果
    (四) 討論
第二部分 microRNA在阿爾茨海默病中的作用研究
    (一) 材料
        1 實驗動物
        2 主要生化試劑
        3 主要溶液配置
        4 主要儀器設(shè)備
    (二) 實驗方法
        1 動物分組
        2 microRNA芯片
        3 Ambion RNA提取試劑盒提取小鼠組織或細胞富含miRNA的總RNA
        4 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)
        5 real-time PCR檢測APPSWE/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型大腦皮層及海馬中microRNA的表達水平變化
        6 has-miR-29C表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細胞
        8 轉(zhuǎn)化后菌落的插入片段陽性克隆快速鑒定
        9 質(zhì)粒DNA的小量提取
        10 菌液小提鑒定陽性克隆
        11 SH-SY5Y細胞的Blasticidine藥物濃度篩選
        12 has-miR-29C質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞
        13 hAPPcDNA質(zhì)粒與has-miR-29C質(zhì)粒共同瞬時轉(zhuǎn)染
        14 hsa miR-29C靶基因的預(yù)測
        15 免疫印跡(Western blot)
        16 SDS-PAGE凝膠電泳
        17 real time PCR檢測靶基因mRNA表達水平
        18. 構(gòu)建APP、NAV3 3’UTR熒光素酶報告載體
        19. 帶有APP、NAV3 mRNA 3’UTR的psiCHECK-2熒光素酶報告基因載體與miR-29c表達載體共轉(zhuǎn)染實驗
        20. 雙熒光素酶報告檢測實驗
    (三)實驗結(jié)果
        1、microRNA芯片檢測結(jié)果
        2、APPSWE/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠及野生小鼠提取RNA結(jié)果
        3 real-time PCR結(jié)果
        4. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細胞
        5. SH-SY5Y細胞的Blasticidine藥物濃度篩選
        6. has miR-29C質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞
        7. has-miR-29c靶基因的預(yù)測
        8. Western blot檢測預(yù)測靶蛋白表達情況
        9. real time PCR檢測靶基因mRNA表達水平
        10. Western blot檢測APPSWE/PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠中APP、BACE1、NAV3蛋白預(yù)測靶蛋白表達情況
        11 hAPPcDNA質(zhì)粒與has-miR-29c質(zhì)粒共同瞬時轉(zhuǎn)染
        12 hBACE1質(zhì)粒與has-miR-29C質(zhì)粒共同瞬時轉(zhuǎn)染
        13 hPI15質(zhì)粒與has-miR-29C質(zhì)粒共同瞬時轉(zhuǎn)染
        14. 構(gòu)建了APP、NAV3 mRNA的3’UTR熒光素酶報告載體
        15. 構(gòu)建了APP mRNA的2個突變3’UTR熒光素酶報告載體
        16. 帶有APP3’UTR的psiCHECK-2熒光素酶報告基因載體與miR-29c表達載體共轉(zhuǎn)染實驗
        17. APP突變3’UTR的psiCHECK-2熒光素酶報告基因載體與miR-29c表達載體共轉(zhuǎn)染實驗
        18 帶有NAV3 3’UTR的psiCHECK-2熒光素酶報告基因載體與miR-29c表達載體共轉(zhuǎn)染實驗
    (四) 討論
        microRNA29c對APP蛋白的表達調(diào)控
        microRNA29c對BACE1蛋白的負性表達調(diào)控
        microRNA29c對NAV3基因的調(diào)控
        microRNA研究技術(shù)
第三部分 miRNA29c轉(zhuǎn)基因小鼠的建立和分析
    (一) 實驗方法
        1. Has-miR-29c轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
        2. 轉(zhuǎn)基因陽性鼠基因型的PCR鼠尾鑒定
        3. Realtime PCR檢測miR-29c轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的表達情況
        4. westyon blot檢測miR-92c轉(zhuǎn)基因陽性小鼠靶蛋白的表達情況
    (二) 結(jié)果
        1. Has-miR-29c轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
        2 PCR鑒定miR-29c轉(zhuǎn)基因陽性小鼠結(jié)果
        3. Realtime PCR檢測miR-29c轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的表達情況
        4. western blot檢測miR-29c轉(zhuǎn)基因陽性小鼠靶蛋白的表達情況
討論
結(jié)論
參考文獻
附錄
英文縮略詞表
致謝



本文編號：3762051