本文關(guān)鍵詞：載脂蛋白E4對大鼠海馬長時程突觸可塑性的影響及其分子機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《山西醫(yī)科大學(xué)》 2014年

載脂蛋白E4對大鼠海馬長時程突觸可塑性的影響及其分子機制研究

喬楓  

【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的慢性、原發(fā)性、且不可逆性的神經(jīng)退行性疾病，其主要表現(xiàn)為進行性認知功能障礙、學(xué)習(xí)和記憶能力喪失，晚期出現(xiàn)嚴重的癡呆[1]。據(jù)報道有四種基因與其發(fā)生有關(guān),包括：淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)[2,3]、早老素-1(presenilin-1, PS-1)[4]、早老素-2(presenilin-2, PS-2)[5,6]和載脂蛋白E4(apolipoprotein-E4, APOE4)[7,8]。其中，APOE4是遲發(fā)型家族性AD(late-onsetFamily Alzheimer’s disease)的主要危險因子。據(jù)統(tǒng)計，單個APOE4基因攜帶者AD的發(fā)病率是未攜帶該基因者的3.6倍，APOE4基因純合子(apoE4+/+)攜帶者的AD發(fā)病率可達到未攜帶者的8倍[7,9]。 APOE4基因過表達后的產(chǎn)物載脂蛋白E4（apolipoprotein E4, apoE4）已被證明具有較強的神經(jīng)毒性。例如，apoE4可以加速淀粉樣β蛋白(Amyloid β-protein,Aβ)生成和沉積[10,11]，易化tau蛋白的高度磷酸化[12,13]，抑制延遲整流鉀通道(delayed-rectifier potassium channels)的活性[14]，并且可以減少樹突棘的密度[15]、樹突的復(fù)雜性和大腦的代謝[16-18]。在細胞培養(yǎng)和人apoE4轉(zhuǎn)基因小鼠(human apoE4target replacement mice)的實驗中發(fā)現(xiàn)apoE4還可以引起炎癥反應(yīng)[19-23]。另外，過表達的apoE4可以損傷小鼠的空間記憶和逃避記憶[24-27]。 然而，在體外apoE4過表達及缺失的小鼠腦片實驗中，apoE4對神經(jīng)突觸可塑性的作用是有爭議的[28-30]；apoE4是否對學(xué)習(xí)記憶的電生理細胞模型——在體海馬晚期時相長時程增強（Later Phase Long Term Potentiation，L-LTP）的誘導(dǎo)和維持產(chǎn)生影響，目前還不清楚。另外，apoE4對兩個在LTP誘導(dǎo)和維持中發(fā)揮重要作用的分子——鈣/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases II, CaMKII)及cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)的作用也不明確。因此，本研究采用在體電生理記錄和分子實驗技術(shù)系統(tǒng)探討了apoE4的神經(jīng)毒性作用及其分子機制。研究主要分為以下兩部分：(1)采用在體大鼠海馬CA1區(qū)場電位記錄方法，觀察了apoE4對L-LTP的誘導(dǎo)及其維持的影響；(2)電生理實驗結(jié)束后，運用免疫組織化學(xué)技術(shù)和Western Blotting技術(shù)檢測了CaMKII和CREB的表達水平及其磷酸化程度。為了證實apeE4的特異性，實驗還采用apoE2作為對照。 第一部分：apoE4引起大鼠在體海馬晚期時相長時程增強的損傷 為闡明apoE4在腦內(nèi)的神經(jīng)毒性作用，我們采用電生理手段記錄大鼠在體海馬場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential, fEPSP)，觀察了急性海馬注射apoE4對對大鼠海馬CA1區(qū)晚期時相的長時程增強(L-LTP)的影響，旨在探討apoE4神經(jīng)毒性作用的電生理學(xué)機制。實驗選用成年雄性SpragueDawley (SD)大鼠，麻醉后固定于腦立體定位儀上，將自制的綁定電極（同心圓雙極刺激電極和單極記錄電極）及注藥管精確插入到海馬的刺激、記錄及給藥部位。在不同時間點給藥，并且通過給予海馬Schaffer側(cè)枝單個測試刺激、雙脈沖刺激及三組高頻刺激(high frequency stimulations, HFSs)，在海馬CA1區(qū)放射層誘發(fā)和記錄基礎(chǔ)fEPSP、配對脈沖引起的雙脈沖易化(paired pulse facilitation,PPF)以及HFSs引起的L-LTP。觀察藥物對基礎(chǔ)fEPSP、PPF及L-LTP的影響。 實驗結(jié)果：(1)各種藥物包括高濃度的apoE4對基礎(chǔ)的突觸傳遞沒有影響；(2)HFSs成功誘導(dǎo)了生理鹽水對照組及apoE2對照組中大鼠海馬L-LTP。生理鹽水對照組的平均fEPSP幅度在HFSs后1分鐘、60分鐘和180分鐘時分別是211±7.2%、170.4±4.5%和161.2±3.3%；apoE2對照組中HFSs后相同時間點的平均fEPSP幅度分別是210.8±8.4%、168.4±4.9%和157.75±3.6%。兩組之間無明顯差異(P0.05)。HFSs前注射0.2μg apoE4后，海馬L-LTP的誘導(dǎo)和維持受到顯著抑制，平均fEPSP幅度在以上三個時間點分別是178.3±5.8%、149.7±5%和142.2±5%，較兩對照組明顯降低（P0.01）。(3)HFSs后注射0.2μg apoE4對L-LTP的維持有輕微但不顯著的抑制作用，平均fEPSP幅度在HFSs后60分鐘和180分鐘分別是155.5±6.5%和143.5±7.9%（P0.05）。即便給予大劑量apoE4（2μg）后，仍然沒有對L-LTP的維持構(gòu)成抑制作用，平均fEPSP幅度在兩個時間點為152.2±6.6%和150.7±4.2%（P0.05）。(4)實驗各組的PPF沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，提示apoE4對L-LTP誘導(dǎo)的抑制作用不是通過突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放介導(dǎo)的。 結(jié)論：apoE4在HFSs前注射損傷海馬L-LTP，而HFSs后注射則沒有損傷作用。這表明apoE4的神經(jīng)毒性作用主要是對L-LTP誘導(dǎo)的抑制，而對維持沒有抑制作用。此外，未受影響的PPF表明ApoE4的L-LTP誘導(dǎo)的抑制作用可能是作用在突觸后的信號通路。 第二部分：ApoE4神經(jīng)毒性作用的分子機制 實驗采用電生理實驗后大鼠的腦組織，分別進行了免疫組織化學(xué)技術(shù)和Western Blotting技術(shù)實驗，，檢測了CaMKIIα和CREB的總蛋白含量及其磷酸化水平。旨在尋找apoE4抑制L-LTP的突觸后信號通路的作用靶點，探討apoE4傷害L-LTP的分子機制。 實驗結(jié)果：(1)免疫組織化學(xué)實驗表明，HFSs前注射0.2μg apoE4不影響CaMKII和CREB總蛋白量的表達。其光密度分別是0.241±0.002和0.249±0.004(p0.05)。在檢測CaMKII和磷酸化CREB實驗中，對照組中光密度分別分別為0.250±0.008和0.275±0.002。相反，apoE4注射組明顯降低了兩種蛋白的磷酸化水平，其光密度分別是0.094±0.002和0.170±0.002(p0.01)。Western Blotting實驗也證實了這一點。注射apoE4后，磷酸化的CaMKII和CREB分別降到了對照組的61.74±5.36%和64.80±12.58%(p0.05)。而總蛋白量沒有變化，分別是對照組的97.25±4.57%和95.24±11.45%(p0.05)。(2)免疫組織化學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，HFSs后注射apoE4不改變CaMKII和CREB的總蛋白量及其磷酸化水平。注射0.2μg apoE4后，磷酸化的CaMKII和CREB的光密度分別是0.231±0.011和0.274±0.003(p0.05)；注射2μg apoE4后，磷酸化的CaMKII和CREB的光密度分別是0.228±0.003和0.278±0.003(p0.05)。與免疫組化實驗相似，Western Blotting也表明無論0.2μg還是2μg的apoE4，CaMKII和CREB的總蛋白量和磷酸化水平都沒有改變(p0.05)。結(jié)論：apoE4通過降低CaMKIIα和CREB磷酸化水平損傷了海馬L-LTP，CaMKIIα and CREB是apoE4發(fā)揮神經(jīng)毒性作用的重要的細胞內(nèi)靶點。 總之，本研究利用在體電生理場電位記錄技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)和Westerm Blotting技術(shù)，通過觀察大鼠在體海馬L-LTP及CaMKIIα、CREB的總蛋白量和磷酸化水平，探討了apoE4神經(jīng)毒性作用及其分子機制。結(jié)果證實，急性apoE4注射可以損傷海馬L-LTP，并且這種神經(jīng)毒性是通過降低突觸后磷酸化CaMKIIα和磷酸化CREB活性而實現(xiàn)的。本研究為apoE4的神經(jīng)毒性作用提供了進一步的電生理和分子生物學(xué)實驗證據(jù)，為預(yù)防和治療AD提供了新的線索。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16
【目錄】：

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本文編號：182090