目的探討HtrA2/Omi對(duì)年輕細(xì)胞和衰老細(xì)胞應(yīng)激下凋亡發(fā)生的作用。方法建立氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）衰老模型;構(gòu)建可誘導(dǎo)過表達(dá)野生型（WT）和酶活性失活突變型HtrA2（S306A）/Omi的慢病毒Tet-On系統(tǒng),用HUVECs建立穩(wěn)轉(zhuǎn)株;利用不同濃度的H₂O₂處理上述細(xì)胞株;衰老相關(guān)β半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色檢測(cè)細(xì)胞衰老,TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡,蛋白免疫印跡及qRT-PCR檢測(cè)HtrA2蛋白及mRNA水平。結(jié)果利用100μmol/L H₂O₂處理細(xì)胞1h成功建立氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的衰老模型;衰老細(xì)胞中HtrA2/Omi的蛋白及mRNA水平相對(duì)于年輕細(xì)胞升高;年輕細(xì)胞受氧化應(yīng)激后,過表達(dá)野生型HtrA2/Omi的細(xì)胞凋亡數(shù)量少于對(duì)照組和過表達(dá)突變型HtrA2/Omi組;而衰老細(xì)胞受氧化應(yīng)激后,過表達(dá)野生型HtrA2/Omi的細(xì)胞發(fā)生凋亡的數(shù)量多于對(duì)照組和過表達(dá)突變型HtrA2/Omi組。結(jié)論年輕細(xì)胞中過表達(dá)HtrA2/Omi能夠抑制凋亡,而在衰老細(xì)胞中過表達(dá)HtrA2/O... 

【文章來源】：成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào). 2020,15(03)

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構(gòu)建細(xì)胞衰老模型及細(xì)胞內(nèi)HtrA2/Omi的表達(dá)

構(gòu)建過表達(dá)HtrA2/Omi的穩(wěn)轉(zhuǎn)株后，首先檢測(cè)其有效性，結(jié)果顯示50μmol/L的DOX即可明顯誘導(dǎo)HtrA2/Omi過表達(dá)，5μmol/L DOX誘導(dǎo)效果不明顯，而500μmol/L和5 000μmol/L DOX誘導(dǎo)的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于本底表達(dá)。有研究[10]證明，大量過表達(dá)HtrA2/Omi會(huì)直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用濃度為50μmol/L的DOX誘導(dǎo)HtrA2/Omi適量過表達(dá)。該結(jié)果證明了過表達(dá)HtrA2/Omi的穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功（圖2）。2.3 HtrA2/Omi增強(qiáng)年輕細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力

分別用濃度為100、200、300μmol/L的H2O2處理HUVEC 3種細(xì)胞株[對(duì)照Ctrl組/過表達(dá)HtrA2(WT）組/突變HtrA2(S306A）組]1h，以未用H2O2處理的這3種細(xì)胞株作為對(duì)照。在未用H2O2處理的對(duì)照組內(nèi)，HUVEC的3種細(xì)胞株數(shù)量無明顯差異；而在用不同濃度H2O2處理的3種凋亡模型中，加DOX誘導(dǎo)HtrA2(WT）組過表達(dá)HtrA2/Omi后細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯少于Ctrl組和HtrA2(S306A）組。然后對(duì)H2O2濃度為100、200、300μmol/L 3個(gè)組別的細(xì)胞剩余數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，隨著H2O2濃度的增加，3種細(xì)胞的剩余數(shù)量逐漸減少，并且在這3個(gè)濃度組別內(nèi)，過表達(dá)野生型HtrA2/Omi的細(xì)胞剩余數(shù)量遠(yuǎn)多于Ctrl組和HtrA2(S306A）組（P<0.001），同時(shí)Ctrl組和HtrA2(S306A）組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖3）。取上面濃度為100μmol/L的H2O2組別的3種細(xì)胞株分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，一組加DOX誘導(dǎo)HtrA2/Omi過表達(dá)，另外一組不加DOX,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h后TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示誘導(dǎo)HtrA2/Omi過表達(dá)的HtrA2(WT）組（6.91±1.26）%細(xì)胞其凋亡率明顯低于未加DOX實(shí)驗(yàn)組的3種細(xì)胞[Ctrl(28.30±1.59）%、WT(29.70±3.27）%和S306A(30.37±2.74）%]以及加DOX實(shí)驗(yàn)組的Ctrl組（25.16±1.87）%細(xì)胞和S306A(HtrA2）組（33.80±1.83）%細(xì)胞，并且未加DOX誘導(dǎo)HtrA2/Omi過表達(dá)的3種細(xì)胞之間無明顯差異，說明DOX不會(huì)對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響。以上結(jié)果證明當(dāng)細(xì)胞受到的應(yīng)激刺激在線粒體可修復(fù)范圍內(nèi)時(shí)，HtrA2/Omi能夠通過提高細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抗性來維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，達(dá)到年輕細(xì)胞抗凋亡的效果（圖4）。


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