本文關(guān)鍵詞：miR-449a通過(guò)靶定Bcl2調(diào)節(jié)自噬影響矽塵誘導(dǎo)的肺纖維化

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【摘要】：矽肺病(Silicosis)是在生產(chǎn)過(guò)程中長(zhǎng)期吸入含較高濃度游離二氧化硅(SiO2)粉塵所導(dǎo)致的以肺部組織彌漫性纖維化為主的全身性疾病,在煤碳、冶金、鐵道及建材等工業(yè)行業(yè)中發(fā)病率較高,是我國(guó)最嚴(yán)重的職業(yè)病之一。大量研究表明矽肺纖維化的重要病理特征為成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖,成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化以及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的過(guò)度沉積。矽肺的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,目前無(wú)特效治療方法,因此探明矽肺的發(fā)病機(jī)制,對(duì)于研究有效的矽肺預(yù)防、診斷和治療方法十分重要。近年來(lái)有研究表明,細(xì)胞自噬與microRNA (miRNA)在肺纖維化發(fā)生過(guò)程中均發(fā)揮重要的作用。自噬作為細(xì)胞經(jīng)典的能量代謝和自我更新機(jī)制,在生物發(fā)育過(guò)程以及維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的作用。自噬發(fā)生標(biāo)志是雙層膜自噬小體的形成,將胞質(zhì)內(nèi)衰老的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和生物大分子等包裹,再與溶酶體融合形成單層膜的自噬溶酶體,溶酶體酶對(duì)其中的包裹物質(zhì)進(jìn)行降解,為細(xì)胞及細(xì)胞器的重構(gòu)、再生與修復(fù)提供原料,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的循環(huán)與再利用。越來(lái)越多的證據(jù)表明,自噬在許多人類(lèi)疾病中發(fā)揮復(fù)雜的調(diào)控作用。其中miRNA通過(guò)靶定重要的自噬相關(guān)基因,對(duì)自噬的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要的作用。miRNA作為一種長(zhǎng)度在18-22個(gè)堿基的非編碼小RNA,通過(guò)與其靶基因mRNA的3'UTR區(qū)完全或部分互補(bǔ)結(jié)合,降解靶mRNA或抑制其翻譯。已有研究表明,miRNA可通過(guò)抑制自噬相關(guān)基因的表達(dá)從而調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平,參與許多疾病如癌癥、神經(jīng)退行性病變等疾病的發(fā)生發(fā)展。目的：(1)建立矽塵誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型,對(duì)小鼠肺組織中自噬活性與miR-449a水平進(jìn)行檢測(cè),在成纖維細(xì)胞模型中進(jìn)行驗(yàn)證。明確自噬活性在矽塵誘導(dǎo)小鼠肺纖維化組織中的變化(2)使用miR-449a mimic與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor, TGF)-β1處理成纖維細(xì)胞,同時(shí)使用agomiR-449a處理矽肺動(dòng)物模型,來(lái)進(jìn)一步證明miR-449a與自噬活性在矽塵誘導(dǎo)肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用。(3)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道及生物信息學(xué)網(wǎng)站分析,預(yù)測(cè)miR-449a作用的自噬相關(guān)靶基因,并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。期望從自噬和miRNA的角度揭示矽肺的部分發(fā)病機(jī)制,最終為矽肺的預(yù)防、早期診斷與治療提供線索。方法：(1)矽塵誘導(dǎo)的小鼠矽肺模型的建立：暴露氣管,一次性直接灌注Si02粉塵懸液的方式建立小鼠肺纖維化模型,通過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)(0、7、14、28天)肺組織病理切片HE染色觀察Si02粉塵誘導(dǎo)小鼠矽肺發(fā)生發(fā)展的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。(2)使用qRT-PCR險(xiǎn)測(cè)矽塵處理不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肺組織中miR-449a的表達(dá)改變,Western Blots檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3與p62的改變情況。(3)使用TGF-β1處理成纖維細(xì)胞構(gòu)建肺纖維化體外模型,qRT-PCR檢測(cè)miR-449a的表達(dá)改變,使用Western Blot檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3與p62的蛋白表達(dá)情況。(4)使用agomiR-449a聯(lián)合矽塵構(gòu)建矽肺小鼠模型,病理切片HE染色觀察小鼠肺組織的纖維化程度,qRT-PCR檢測(cè)]miR-449a的表達(dá)改變,使用Western Blot檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3與p62的蛋白表達(dá)情況。使用miR-449a mimic轉(zhuǎn)染聯(lián)合TGF-β1處理NIH-3T3與MRC-5細(xì)胞,使用Western Blot檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3與p62的蛋白表達(dá)情況,免疫熒光檢測(cè)p62的表達(dá),轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒檢測(cè)自噬活性,同時(shí)使用透射電鏡觀察NIH-3T3細(xì)胞中自噬小體數(shù)目的改變情況。(5)進(jìn)一步通過(guò)查閱文獻(xiàn)并結(jié)合miRDB、 TargetScan、PicTar、DIANA-microT等生物信息學(xué)軟件找出miR-449a的自制相關(guān)的靶基因Bc12,并使用Western Blot和熒光素酶報(bào)告基因的方法進(jìn)行驗(yàn)證。(6)Western Blot檢測(cè)TGF-β1處理后,Western Blot檢測(cè)ERK1/2的磷酸化水平。結(jié)果：1.小鼠矽肺組織中miR-449a:表達(dá)下降,自噬活性受到抑制：病理切片HE染色顯示,在Si02粉塵處理的第7天,即可見(jiàn)肺泡內(nèi)有明顯的炎性細(xì)胞聚集,第28天時(shí)可見(jiàn)大量的蔥皮樣矽結(jié)節(jié)存在,肺組織廣泛纖維化。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)0、7、14、28天小鼠肺組織中miR-449a的水平逐漸下降。使用Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)0、7、14、28天小鼠肺組織中上皮標(biāo)志物E-Cadherin表達(dá)逐漸下降,I型膠原(CollagenI)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、纖連蛋白(fibronectin)、波形蛋白(vimentin)、p62的表達(dá)逐漸增加,LC3Ⅱ/LC3I的比值逐漸下降。說(shuō)明隨著矽肺的發(fā)生發(fā)展,小鼠肺組織中miR-449a的表達(dá)及自噬活性均受到抑制。2. TGF-β1可抑制成纖維細(xì)胞自噬：miR-449a的表達(dá)：使用不同濃度(0、1、2、5ng/ml)TGF-β1處理小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系(NIH-3T3)和人正常胚肺成纖維細(xì)胞系(MRC-5)處理24小時(shí),或使用2ng/ml TGF-β1處理NIH-3T3和MRC-5細(xì)胞系不同時(shí)間(0、12、24、48小時(shí)),發(fā)現(xiàn)vimentin、fibronectin和p62的表達(dá)水平隨著TGF-β1處理的濃度和時(shí)間而逐漸增加,而LC3Ⅱ/LC3I的比值則逐漸下降。使用2ng/ml TGF-β1處理兩種細(xì)胞系48小時(shí)后,用qRT-PCR檢測(cè)miR-449a的水平較對(duì)照組顯著下降。說(shuō)明使用TGF-β1構(gòu)造的肺纖維化體外模型中,自噬活性與miR-449a的水平與體內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)果一致,均受到抑制。3.高表達(dá)miR-449a可抑制SiO2誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化：在矽肺模型中觀察到,高表達(dá)miR-449a組小鼠肺組織病理切片與單純Si02處理組相比,肺纖維化評(píng)分明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺組織中的Collagen Ⅰ、α-SMA、fibronectin和vimentin較單純Si02處理組相比顯著下降。自噬標(biāo)志物p62的表達(dá)下降,而LC3Ⅱ/LC3I的比值上升。提示miR-449a能顯著降低肺纖維化的程度,其機(jī)制可能與自噬有關(guān)。4. miR-449a能增加成纖維細(xì)胞的自噬活性：體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,高表達(dá)miR-449a之后,NIH-3T3與MRC-5的Collagen Ⅰ、α-SMA、fibronectin與vimentin的表達(dá)均下降,自噬標(biāo)志物p62的表達(dá)下降,LC3II/LC3I的比值上升。免疫熒光結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-449a后p62的表達(dá)下降。轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn),高表達(dá)miR-449a后NIH-3T3細(xì)胞中綠色熒光斑點(diǎn)數(shù)目增加,表示細(xì)胞自噬活性增加。激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高表達(dá)miR-449a后NIH-3T3細(xì)胞內(nèi)自噬小體的數(shù)目顯著增加。這些均提示miR-449a能增加成纖維細(xì)胞的自噬活性。5. miR-449a通過(guò)靶向作用于Bc12增加細(xì)胞自噬：應(yīng)用多種生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-449a作用的靶基因,發(fā)現(xiàn)在Bc12的3'UTR區(qū)存在miR-449a種子序列的結(jié)合位點(diǎn),提示Bc12可能是miR-449a的靶基因。進(jìn)一步用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來(lái)驗(yàn)證,轉(zhuǎn)染miR-449a后,NIH-3T3細(xì)胞的Bc12蛋白水平下降,顯示同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-449a mimic與Bc12野生型質(zhì)粒后,熒光活性較同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-449a mimic與Bc12突變型質(zhì)粒相比顯著下降。提示Bc12是miR-449a的靶基因。6.TGF-β1通過(guò)ERK信號(hào)通路抑制Bcl2的降解：Bcl2的蛋白水平隨著TGF-β1處理的濃度和時(shí)間的增加而逐漸增加。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ERK1/2的磷酸化水平也隨著TGF-β1處理的濃度和時(shí)間的增加而逐漸增加,提示TGF-β1通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路抑制了Bc12的降解,從而使得細(xì)胞的自噬水平受到抑制。結(jié)論：在Si02誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,miR-449a隨著肺纖維化的發(fā)展而逐漸下降,同時(shí)自噬活性受到抑制。高表達(dá)miR-449a后,小鼠的肺纖維化受到抑制,同時(shí)肺組織細(xì)胞自噬活性增加,使用TGF-β1處理成纖維細(xì)胞構(gòu)建的纖維化體外模型驗(yàn)證了這一點(diǎn)。miR-449a通過(guò)其靶基因Bc12發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬活性的作用,自噬活性增加的同時(shí)可能抑制了成纖維細(xì)胞的增殖,從而發(fā)揮抑制肺纖維化的作用。TGF-β1通過(guò)激活ERKl/2信號(hào)通路,從而抑制了Bc12的降解,抑制細(xì)胞的自噬水平。這些結(jié)果均提示miR-449a負(fù)調(diào)控Bc12的表達(dá),影響了肺成纖維細(xì)胞的自噬水平,從而影響了肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：矽肺 miR-449a 自噬 Bcl2
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R135.2
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-17
• 前言17-20
• 材料和方法20-8
• 結(jié)果8-52
• 討論52-57
• 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-64
• 綜述64-82
• 參考文獻(xiàn)73-82
• 碩士期間發(fā)表論文82-83
• 致謝83

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本文編號(hào)：764728