本文關(guān)鍵詞：miR-449a通過靶定Bcl2調(diào)節(jié)自噬影響矽塵誘導(dǎo)的肺纖維化

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【摘要】：矽肺病(Silicosis)是在生產(chǎn)過程中長期吸入含較高濃度游離二氧化硅(SiO2)粉塵所導(dǎo)致的以肺部組織彌漫性纖維化為主的全身性疾病,在煤碳、冶金、鐵道及建材等工業(yè)行業(yè)中發(fā)病率較高,是我國最嚴(yán)重的職業(yè)病之一。大量研究表明矽肺纖維化的重要病理特征為成纖維細胞過度增殖,成纖維細胞向肌成纖維細胞分化以及細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的過度沉積。矽肺的發(fā)病機制尚未完全闡明,目前無特效治療方法,因此探明矽肺的發(fā)病機制,對于研究有效的矽肺預(yù)防、診斷和治療方法十分重要。近年來有研究表明,細胞自噬與microRNA (miRNA)在肺纖維化發(fā)生過程中均發(fā)揮重要的作用。自噬作為細胞經(jīng)典的能量代謝和自我更新機制,在生物發(fā)育過程以及維持機體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的作用。自噬發(fā)生標(biāo)志是雙層膜自噬小體的形成,將胞質(zhì)內(nèi)衰老的細胞器、蛋白質(zhì)和生物大分子等包裹,再與溶酶體融合形成單層膜的自噬溶酶體,溶酶體酶對其中的包裹物質(zhì)進行降解,為細胞及細胞器的重構(gòu)、再生與修復(fù)提供原料,實現(xiàn)細胞內(nèi)物質(zhì)的循環(huán)與再利用。越來越多的證據(jù)表明,自噬在許多人類疾病中發(fā)揮復(fù)雜的調(diào)控作用。其中miRNA通過靶定重要的自噬相關(guān)基因,對自噬的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要的作用。miRNA作為一種長度在18-22個堿基的非編碼小RNA,通過與其靶基因mRNA的3'UTR區(qū)完全或部分互補結(jié)合,降解靶mRNA或抑制其翻譯。已有研究表明,miRNA可通過抑制自噬相關(guān)基因的表達從而調(diào)節(jié)細胞自噬水平,參與許多疾病如癌癥、神經(jīng)退行性病變等疾病的發(fā)生發(fā)展。目的：(1)建立矽塵誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型,對小鼠肺組織中自噬活性與miR-449a水平進行檢測,在成纖維細胞模型中進行驗證。明確自噬活性在矽塵誘導(dǎo)小鼠肺纖維化組織中的變化(2)使用miR-449a mimic與轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)-β1處理成纖維細胞,同時使用agomiR-449a處理矽肺動物模型,來進一步證明miR-449a與自噬活性在矽塵誘導(dǎo)肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用。(3)結(jié)合相關(guān)文獻報道及生物信息學(xué)網(wǎng)站分析,預(yù)測miR-449a作用的自噬相關(guān)靶基因,并對其進行驗證。期望從自噬和miRNA的角度揭示矽肺的部分發(fā)病機制,最終為矽肺的預(yù)防、早期診斷與治療提供線索。方法：(1)矽塵誘導(dǎo)的小鼠矽肺模型的建立：暴露氣管,一次性直接灌注Si02粉塵懸液的方式建立小鼠肺纖維化模型,通過不同時間點(0、7、14、28天)肺組織病理切片HE染色觀察Si02粉塵誘導(dǎo)小鼠矽肺發(fā)生發(fā)展的動態(tài)變化過程。(2)使用qRT-PCR險測矽塵處理不同時間點小鼠肺組織中miR-449a的表達改變,Western Blots檢測自噬標(biāo)志物L(fēng)C3與p62的改變情況。(3)使用TGF-β1處理成纖維細胞構(gòu)建肺纖維化體外模型,qRT-PCR檢測miR-449a的表達改變,使用Western Blot檢測自噬標(biāo)志物L(fēng)C3與p62的蛋白表達情況。(4)使用agomiR-449a聯(lián)合矽塵構(gòu)建矽肺小鼠模型,病理切片HE染色觀察小鼠肺組織的纖維化程度,qRT-PCR檢測]miR-449a的表達改變,使用Western Blot檢測自噬標(biāo)志物L(fēng)C3與p62的蛋白表達情況。使用miR-449a mimic轉(zhuǎn)染聯(lián)合TGF-β1處理NIH-3T3與MRC-5細胞,使用Western Blot檢測自噬標(biāo)志物L(fēng)C3與p62的蛋白表達情況,免疫熒光檢測p62的表達,轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒檢測自噬活性,同時使用透射電鏡觀察NIH-3T3細胞中自噬小體數(shù)目的改變情況。(5)進一步通過查閱文獻并結(jié)合miRDB、 TargetScan、PicTar、DIANA-microT等生物信息學(xué)軟件找出miR-449a的自制相關(guān)的靶基因Bc12,并使用Western Blot和熒光素酶報告基因的方法進行驗證。(6)Western Blot檢測TGF-β1處理后,Western Blot檢測ERK1/2的磷酸化水平。結(jié)果：1.小鼠矽肺組織中miR-449a:表達下降,自噬活性受到抑制：病理切片HE染色顯示,在Si02粉塵處理的第7天,即可見肺泡內(nèi)有明顯的炎性細胞聚集,第28天時可見大量的蔥皮樣矽結(jié)節(jié)存在,肺組織廣泛纖維化。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)0、7、14、28天小鼠肺組織中miR-449a的水平逐漸下降。使用Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)0、7、14、28天小鼠肺組織中上皮標(biāo)志物E-Cadherin表達逐漸下降,I型膠原(CollagenI)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、纖連蛋白(fibronectin)、波形蛋白(vimentin)、p62的表達逐漸增加,LC3Ⅱ/LC3I的比值逐漸下降。說明隨著矽肺的發(fā)生發(fā)展,小鼠肺組織中miR-449a的表達及自噬活性均受到抑制。2. TGF-β1可抑制成纖維細胞自噬：miR-449a的表達：使用不同濃度(0、1、2、5ng/ml)TGF-β1處理小鼠胚胎成纖維細胞系(NIH-3T3)和人正常胚肺成纖維細胞系(MRC-5)處理24小時,或使用2ng/ml TGF-β1處理NIH-3T3和MRC-5細胞系不同時間(0、12、24、48小時),發(fā)現(xiàn)vimentin、fibronectin和p62的表達水平隨著TGF-β1處理的濃度和時間而逐漸增加,而LC3Ⅱ/LC3I的比值則逐漸下降。使用2ng/ml TGF-β1處理兩種細胞系48小時后,用qRT-PCR檢測miR-449a的水平較對照組顯著下降。說明使用TGF-β1構(gòu)造的肺纖維化體外模型中,自噬活性與miR-449a的水平與體內(nèi)試驗的結(jié)果一致,均受到抑制。3.高表達miR-449a可抑制SiO2誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化：在矽肺模型中觀察到,高表達miR-449a組小鼠肺組織病理切片與單純Si02處理組相比,肺纖維化評分明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。肺組織中的Collagen Ⅰ、α-SMA、fibronectin和vimentin較單純Si02處理組相比顯著下降。自噬標(biāo)志物p62的表達下降,而LC3Ⅱ/LC3I的比值上升。提示miR-449a能顯著降低肺纖維化的程度,其機制可能與自噬有關(guān)。4. miR-449a能增加成纖維細胞的自噬活性：體外實驗的結(jié)果顯示,高表達miR-449a之后,NIH-3T3與MRC-5的Collagen Ⅰ、α-SMA、fibronectin與vimentin的表達均下降,自噬標(biāo)志物p62的表達下降,LC3II/LC3I的比值上升。免疫熒光結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-449a后p62的表達下降。轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn),高表達miR-449a后NIH-3T3細胞中綠色熒光斑點數(shù)目增加,表示細胞自噬活性增加。激光共聚焦實驗結(jié)果顯示,高表達miR-449a后NIH-3T3細胞內(nèi)自噬小體的數(shù)目顯著增加。這些均提示miR-449a能增加成纖維細胞的自噬活性。5. miR-449a通過靶向作用于Bc12增加細胞自噬：應(yīng)用多種生物學(xué)軟件預(yù)測miR-449a作用的靶基因,發(fā)現(xiàn)在Bc12的3'UTR區(qū)存在miR-449a種子序列的結(jié)合位點,提示Bc12可能是miR-449a的靶基因。進一步用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀬眚炞C,轉(zhuǎn)染miR-449a后,NIH-3T3細胞的Bc12蛋白水平下降,顯示同時轉(zhuǎn)染miR-449a mimic與Bc12野生型質(zhì)粒后,熒光活性較同時轉(zhuǎn)染miR-449a mimic與Bc12突變型質(zhì)粒相比顯著下降。提示Bc12是miR-449a的靶基因。6.TGF-β1通過ERK信號通路抑制Bcl2的降解：Bcl2的蛋白水平隨著TGF-β1處理的濃度和時間的增加而逐漸增加。Western blot實驗結(jié)果顯示,ERK1/2的磷酸化水平也隨著TGF-β1處理的濃度和時間的增加而逐漸增加,提示TGF-β1通過ERK1/2信號通路抑制了Bc12的降解,從而使得細胞的自噬水平受到抑制。結(jié)論：在Si02誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中,miR-449a隨著肺纖維化的發(fā)展而逐漸下降,同時自噬活性受到抑制。高表達miR-449a后,小鼠的肺纖維化受到抑制,同時肺組織細胞自噬活性增加,使用TGF-β1處理成纖維細胞構(gòu)建的纖維化體外模型驗證了這一點。miR-449a通過其靶基因Bc12發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞自噬活性的作用,自噬活性增加的同時可能抑制了成纖維細胞的增殖,從而發(fā)揮抑制肺纖維化的作用。TGF-β1通過激活ERKl/2信號通路,從而抑制了Bc12的降解,抑制細胞的自噬水平。這些結(jié)果均提示miR-449a負調(diào)控Bc12的表達,影響了肺成纖維細胞的自噬水平,從而影響了肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：矽肺 miR-449a 自噬 Bcl2
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R135.2
【目錄】：

• 縮略語5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-17
• 前言17-20
• 材料和方法20-8
• 結(jié)果8-52
• 討論52-57
• 結(jié)論57-58
• 參考文獻58-64
• 綜述64-82
• 參考文獻73-82
• 碩士期間發(fā)表論文82-83
• 致謝83

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本文編號：764728