本文關(guān)鍵詞：H5N1型禽流感病毒和納米材料引起急性肺損傷的機(jī)制研究和防治藥物篩選

  更多相關(guān)文章： H5N1型禽流感病毒 急性肺損傷 Ang Ⅱ 氯沙坦 氯喹 氧化銅納米顆粒 自噬

【摘要】：H5N1型禽流感病毒導(dǎo)致急性肺損傷的致病機(jī)理研究和防治藥物篩選自2003年發(fā)現(xiàn)H5N1型高致病性禽流感病毒能夠感染人體以來(lái),經(jīng)WHO統(tǒng)計(jì),截至目前全世界范圍內(nèi)共有784人感染H5N1病毒,其中429人死亡,整體死亡率高達(dá)54.7%。加之相關(guān)研究報(bào)道已證實(shí),H5N1病毒僅需在HA蛋白和PB2蛋白上的數(shù)個(gè)氨基酸突變即可通過(guò)空氣在雪貂之間傳播。面對(duì)H5N1病毒居高不下的死亡率和為數(shù)不多的可供選擇的藥物,我們將研究重點(diǎn)集中于H5N1型禽流感病毒的致病機(jī)理解析和發(fā)現(xiàn)新的可用于治療H5N1病毒感染的藥物和方法。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)了腎素-血管緊張素系統(tǒng)在H5N1病毒感染導(dǎo)致的急性肺損傷中發(fā)揮重要功能,RAS效應(yīng)分子AngⅡ被上調(diào)且介導(dǎo)急性肺損傷,而AngⅡ負(fù)向調(diào)控蛋白ACE2則具有保護(hù)功能,且可通過(guò)預(yù)防聯(lián)合治療性給藥緩解小鼠急性肺損傷癥狀并挽救小鼠死亡。在本項(xiàng)目中,我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),H5N1型高致病性禽流感病毒感染人體后同樣會(huì)引起AngⅡ的顯著上調(diào),并通過(guò)檢測(cè)H5N1病毒感染后連續(xù)時(shí)間點(diǎn)AngⅡ表達(dá)水平證明,其整體表達(dá)水平,變化趨勢(shì)和最終濃度可能作為反應(yīng)H5N1病毒感染患者最終是否致死的重要指標(biāo)之一。而ACE2蛋白的保護(hù)機(jī)制則可能包括降低AngⅡ的表達(dá),抑制病毒復(fù)制并降低病毒載量等。進(jìn)一步,根據(jù)老藥新用的理念,我們對(duì)一系列臨床使用藥物在H5N1病毒感染動(dòng)物模型上進(jìn)行了治療效果的嘗試,發(fā)現(xiàn)臨床抗瘧疾藥物氯喹和臨床降壓藥氯沙坦可分別通過(guò)不同的機(jī)制來(lái)緩解H5N1病毒引起的急性肺損傷癥狀,但ACEi類藥物和他汀類藥物經(jīng)檢測(cè)后并不具有明顯的治療效果。上述研究提供了多種可用于治療H5N1病毒感染的臨床候選藥物。氧化銅納米顆�？梢餉549細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡金屬氧化物納米顆粒已被用于酶催化,環(huán)境檢測(cè)和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品等多個(gè)領(lǐng)域,是目前應(yīng)用最廣泛的一類納米顆粒。我們之前對(duì)部分常見(jiàn)的金屬氧化物納米顆粒如二氧化硅,二氧化鈦,氧化銅,四氧化三鐵等對(duì)呼吸道細(xì)胞毒性研究發(fā)現(xiàn),僅氧化銅納米顆粒可引起呼吸道細(xì)胞顯著的細(xì)胞死亡。在本課題中,我們又進(jìn)一步地對(duì)氧化銅納米顆粒引起細(xì)胞死亡的種類和機(jī)制進(jìn)行探索,通過(guò)電鏡觀察自噬小泡,confocal觀察LC3蛋白聚集的細(xì)胞數(shù)量及加入巴佛洛霉素A1藥物觀察自噬潮等指標(biāo),我們發(fā)現(xiàn)其能夠引起細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的自噬現(xiàn)象,進(jìn)一步通過(guò)siRNA或自噬抑制劑進(jìn)行作用后,氧化銅納米顆粒引起的細(xì)胞死亡得到顯著緩解,證明氧化銅納米顆�？梢砸鸷粑兰�(xì)胞的自噬性死亡。
【關(guān)鍵詞】：H5N1型禽流感病毒 急性肺損傷 Ang Ⅱ 氯沙坦 氯喹 氧化銅納米顆粒 自噬
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R563
【目錄】：

• 中文摘要13-15
• Abstract15-18
• 英文略語(yǔ)表18-20
• 序言20-21
• 第一部分 H5N1型禽流感病毒導(dǎo)致急性肺損傷機(jī)理的研究和臨床防治藥物的篩選21-89
• 第一節(jié) RAS系統(tǒng)在H5N1型禽流感病毒導(dǎo)致急性肺損傷過(guò)程中的研究22-58
• 前言22-25
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料25-26
• 1.1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物25
• 1.2. 實(shí)驗(yàn)試劑25
• 1.2.1. 試劑盒25
• 1.2.2. 細(xì)胞株25
• 1.2.3. 病毒株25
• 1.2.4. H5N1禽流感病毒蛋白表達(dá)質(zhì)粒25
• 1.3. 主要生化試劑和抗體25-26
• 1.4. 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染試劑26
• 1.5. 主要使用藥物26
• 2. 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備26-27
• 3. 主要溶液配置27
• 3.1. 細(xì)胞凍存液的配制27
• 3.2. 細(xì)胞裂解液的配制27
• 3.3. SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳及相關(guān)緩沖液的配制27
• 3.4. 常用緩沖液的配置27
• 4. 實(shí)驗(yàn)方法27-41
• 4.1. H5N1禽流感病毒感染患者和健康對(duì)照者入組和基本信息27-28
• 4.2. 人血漿AngⅡ的測(cè)定28-29
• 4.3. 小鼠血漿AngⅡ的測(cè)定29-31
• 4.4. 小鼠肺組織病毒50%培養(yǎng)組織感染劑量(TCID_(50))的測(cè)定31-32
• 4.4.1. 流感病毒TCID_(50)測(cè)定組肺組織樣品收取和處理31-32
• 4.4.2. 流感病毒50%培養(yǎng)組織感染劑量(TCID_(50))的測(cè)定32
• 4.5. 小鼠肺組織RNA收取和基因表達(dá)變化檢測(cè)32-35
• 4.5.1. 肺組織樣品收取和處理32-33
• 4.5.2. 小鼠肺組織樣品RNA提取33-34
• 4.5.3. RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA34
• 4.5.4. 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)變化34-35
• 4.6. 小鼠肺組織濕干重量比測(cè)定35-36
• 4.7. 小鼠肺組織病理檢測(cè)及炎性浸潤(rùn)細(xì)胞計(jì)數(shù)和肺損傷程度評(píng)分36-37
• 4.8. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒37
• 4.9. 細(xì)胞RNA樣品收取和熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)37-38
• 4.9.1. 細(xì)胞RNA樣品收取和處理38
• 4.9.2. 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Ace2基因變化38
• 4.10. 細(xì)胞和肺組織蛋白樣品收取和Western Blotting檢測(cè)38-41
• 4.10.1. 細(xì)胞蛋白樣品收取和處理38
• 4.10.2. 肺組織蛋白樣品收取和處理38-39
• 4.10.3. 細(xì)胞和組織蛋白樣品濃度測(cè)定和調(diào)整39-40
• 4.10.4. Western blotting檢測(cè)40-41
• 4.11. 小鼠生存率檢測(cè)41
• 5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-55
• 5.1. H5N1病毒感染病人血清中Ang Ⅱ水平升高41-42
• 5.2. H5N1病毒感染死亡病人Ang Ⅱ表達(dá)持續(xù)升高42-43
• 5.3. H5N1病毒感染死亡小鼠Ang Ⅱ表達(dá)持續(xù)升高43-44
• 5.4. Ace2基因敲除有利于病毒基因復(fù)制44
• 5.5. Ace2基因敲除小鼠肺組織中病毒含量更高44-45
• 5.6. 注射ACE2蛋白可以降低病毒復(fù)制45-46
• 5.7. 注射ACE2蛋白可以降低Ang Ⅱ表達(dá)46
• 5.8. ACE2蛋白單獨(dú)治療可以改善小鼠肺水腫程度46-47
• 5.9. ACE2蛋白單獨(dú)治療可以改善小鼠肺組織病理?yè)p傷程度47-48
• 5.10. ACE2蛋白單獨(dú)治療可以降低Ang Ⅱ表達(dá)48
• 5.11. 單個(gè)H5N1病毒蛋白對(duì)Ace2 mRNA表達(dá)水平?jīng)]有影響48-49
• 5.12. 單個(gè)H5N1病毒蛋白對(duì)ACE2蛋白表達(dá)水平?jīng)]有影響49-50
• 5.13. 使用氯沙坦治療可以顯著提高小鼠生存率50-51
• 5.14. 使用氯沙坦治療可以改善小鼠肺水腫程度51-52
• 5.15. 使用氯沙坦治療可以改善小鼠肺組織病理?yè)p傷程度52
• 5.16. 使用氯沙坦治療對(duì)H5N1病毒復(fù)制沒(méi)有影響52-53
• 5.17. 使用氯沙坦治療可降低肺組織ⅡL-6表達(dá)量53-54
• 5.18. 使用氯沙坦治療可促進(jìn)RAS穩(wěn)態(tài)平衡54-55
• 6. 實(shí)驗(yàn)結(jié)論55-56
• 7. 討論56-58
• 第二節(jié) H5N1型禽流感病毒導(dǎo)致急性肺損傷的候選臨床治療藥物篩選58-89
• 前言58-60
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料60
• 1.1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60
• 1.2. 實(shí)驗(yàn)試劑60
• 1.2.1. 試劑盒60
• 1.2.2. 細(xì)胞株60
• 1.2.3. 病毒株60
• 1.3. 主要生化試劑和抗體60
• 1.4. 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染試劑60
• 1.5. 主要使用藥物60
• 2. 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備60-61
• 3. 主要溶液配置61-62
• 3.1. 細(xì)胞凍存液的配制61
• 3.2. 細(xì)胞裂解液的配制61
• 3.3. SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳及相關(guān)緩沖液的配制61-62
• 3.4. 常用緩沖液的配置62
• 4. 實(shí)驗(yàn)方法62-71
• 4.1. 氯喹預(yù)防或治療H5N1病毒感染A549細(xì)胞的細(xì)胞活力測(cè)定62-63
• 4.2. 小鼠生存率檢測(cè)和體重變化統(tǒng)計(jì)63-64
• 4.3. 小鼠肺組織濕干重量比測(cè)定64
• 4.4. 小鼠肺組織病理檢測(cè)及炎性浸潤(rùn)細(xì)胞計(jì)數(shù)64-65
• 4.5. qRT-PCR檢測(cè)小鼠肺組織mRNA表達(dá)變化65-68
• 4.5.1. 肺組織樣品收取和處理65-66
• 4.5.2. 小鼠肺組織樣品RNA提取66
• 4.5.3. RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA66-67
• 4.5.4. 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)變化67-68
• 4.6. Western Blotting檢測(cè)小鼠肺組織蛋白表達(dá)變化68-71
• 4.6.1. 肺組織蛋白樣品收取和處理68-69
• 4.6.2. 細(xì)胞和組織蛋白樣品濃度測(cè)定和調(diào)整69-70
• 4.6.3. Western blotting檢測(cè)70-71
• 5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果71-86
• 5.1. 氯喹可挽救H5N1型禽流感病毒導(dǎo)致的細(xì)胞死亡71-72
• 5.2. 氯喹預(yù)防給藥不能明顯提高小鼠生存率72
• 5.3. 氯喹預(yù)防給藥不能明顯改善小鼠肺水腫程度72-73
• 5.4. 氯喹預(yù)防給藥不能明顯改善小鼠肺組織病理?yè)p傷程度73-74
• 5.5. 氯喹治療給藥可以明顯提高小鼠生存率74
• 5.6. 氯喹治療給藥可以明顯改善小鼠肺水腫程度74-75
• 5.7. 氯喹治療給藥可以明顯改善小鼠肺組織病理?yè)p傷程度75-76
• 5.8. 氯喹治療給藥后小鼠肺組織自噬程度顯著降低76
• 5.9. 氯喹治療給藥后對(duì)H5N1病毒復(fù)制沒(méi)有影響76-77
• 5.10. 使用氯喹治療不能降低肺組織炎性因子表達(dá)量77-78
• 5.11. H5N1型禽流感病毒滴鼻感染小鼠模型生存率78-79
• 5.12. H5N1型禽流感病毒滴鼻感染小鼠模型體重變化79
• 5.13. 依那普利治療不能顯著提高小鼠生存率79-80
• 5.14. 依那普利治療不能緩解小鼠體重下降80-81
• 5.15. 依那普利治療不能顯著緩解小鼠肺水腫81
• 5.16. 卡托普利治療不能顯著提高小鼠生存率81-82
• 5.17. 卡托普利治療不能緩解小鼠體重下降82
• 5.18. 卡托普利治療不能緩解小鼠肺水腫82-83
• 5.19. 辛伐他汀治療不能顯著提高小鼠生存率83
• 5.20. 辛伐他汀治療不能緩解小鼠體重下降83-84
• 5.21. 辛伐他汀治療不能緩解小鼠肺水腫84
• 5.22. 普伐他汀治療不能緩解小鼠肺水腫84-85
• 5.23. 普伐他汀和氯沙坦聯(lián)合治療不能緩解小鼠肺水腫85-86
• 6. 結(jié)論86-87
• 7. 討論87-89
• 第二部分 氧化銅(CuO)納米顆�？梢餉549細(xì)胞產(chǎn)生自噬性的細(xì)胞死亡89-108
• 前言90-91
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料91-92
• 1.1. 實(shí)驗(yàn)試劑91
• 1.1.1. 試劑盒91
• 1.1.2. 細(xì)胞株91
• 1.1.3. LC3-GFP2表達(dá)質(zhì)粒91
• 1.2. 主要生化試劑和抗體91
• 1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染試劑91
• 1.4 納米顆粒和藥物91-92
• 2. 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備92
• 3. 主要溶液配置92-93
• 3.1. 細(xì)胞凍存液的配制92
• 3.2. 電鏡樣品固定液的配置92-93
• 3.3. 常用緩沖液的配置93
• 3.4. 細(xì)胞裂解液的配制93
• 3.5. SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳及相關(guān)緩沖液的配制93
• 4. 實(shí)驗(yàn)方法93-99
• 4.1. 氧化銅納米顆粒感染A549細(xì)胞后細(xì)胞活力檢測(cè)93-94
• 4.2. 氧化銅納米顆粒感染A549細(xì)胞電鏡觀察94-95
• 4.3. 氧化銅納米顆粒感染A549細(xì)胞熒光共聚焦顯微鏡觀察95-96
• 4.4. 氧化銅納米顆粒引起A549細(xì)胞自噬潮現(xiàn)象檢測(cè)96-99
• 4.4.1. BFA1處理細(xì)胞蛋白樣品收集96
• 4.4.2. 蛋白樣品濃度測(cè)定與調(diào)整96-97
• 4.4.3. Western blotting檢測(cè)自噬潮現(xiàn)象97-98
• 4.4.4. Western blotting定量分析98-99
• 4.5. Atg 5基因siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)99
• 5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果99-106
• 5.1. 氧化銅納米顆�？蓪�(dǎo)致A549細(xì)胞死亡且呈梯度效應(yīng)100
• 5.2. 氧化銅納米顆�？稍黾覣549細(xì)胞中的自噬小泡100-101
• 5.3. 氧化銅納米顆�？纱龠M(jìn)LC3蛋白聚集101-102
• 5.4. 氧化銅納米顆�？梢鹱允沙�102-103
• 5.5. 敲低Atg 5基因可挽救氧化銅納米顆粒導(dǎo)致的細(xì)胞死亡103
• 5.6. 敲低Atg 5基因可降低細(xì)胞自噬程度103-104
• 5.7. 敲低Atg 5基因可挽救氧化銅納米顆粒導(dǎo)致的細(xì)胞死亡104-105
• 5.8. 自噬抑制劑可挽救氧化銅納米顆粒導(dǎo)致的細(xì)胞死亡105-106
• 6. 結(jié)論106-107
• 7. 討論107-108
• 參考文獻(xiàn)108-116
• 綜述116-132
• 參考文獻(xiàn)123-132
• 致謝132-133
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷133-136

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

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本文編號(hào)：694735