本文關(guān)鍵詞：拴鏈因子Exocyst與皮層肌動結(jié)合蛋白Cortactin在黏液高分泌中的耦聯(lián)效應

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【摘要】：目的明確COPD患者和正常人群支氣管上皮和人支氣管上皮細胞16HBE細胞株中Exocyst復合物的定位和表達情況。構(gòu)建離體黏液高分泌細胞模型，探討拴鏈因子Exocyst復合物在中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）介導的氣道粘蛋白5AC（MUC5AC）高分泌中的調(diào)控作用。并就拴鏈復合物Exocyst和皮層肌動結(jié)合蛋白Cortactin在該過程中的耦聯(lián)作用進行初步探討。 方法 (1)目標人群和人支氣管上皮16HBE細胞株中Sec3的定位和表達情況 免疫組織化學法檢測目標人群支氣管上皮中Sec3蛋白的分布特征，細胞免疫熒光法檢測NE前后16HBE細胞株中Sec3蛋白的胞內(nèi)分布情況，real-time PCR和western blotting法分別檢測目標人群氣管上皮和16HBE細胞株中Sec3mRNA和蛋白的差異性表達。 (2)拴鏈因子Exocyst復合物的促黏液分泌效應 構(gòu)建兩條Sec3-shRNA并穩(wěn)轉(zhuǎn)16HBE細胞株，real-time PCR法和western blotting法檢測Sec3特異性shRNA的沉默效率。給予最適NE濃度和時長刺激16HBE細胞，real-time PCR法和ELISA法觀察各組細胞MUC5AC mRNA和蛋白的表達量，明確Sec3亞基在促黏液分泌過程中的調(diào)控作用。 (3)拴鏈因子Exocyst和皮層肌動結(jié)合蛋白Cortactin的促黏液分泌耦聯(lián)效應 分別構(gòu)建Cortactin-shRNA和Sec3-shRNA的單獨轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染細胞株，real-time PCR法和western blotting法檢測Cortactin-shRNA的沉默效率。Real-time PCR法和ELISA法觀察各組細胞MUC5ACmRNA和蛋白的表達量，免疫共沉淀技術(shù)和細胞免疫熒光雙標技術(shù)檢測細胞內(nèi)Sec3和Cortactin的相互作用和共定位，明確Sec3和Cortactin在促黏液分泌過程中的耦聯(lián)效應。 結(jié)果 (1)目標人群和人支氣管16HBE細胞株Sec3的表達情況 COPD患者和正常人群支氣管上皮細胞均表達有Sec3，均富集于靠管腔面細胞頂端，且COPD患者中Sec3表達明顯高于正常人群。人支氣管上皮16HBE細胞中表達有Sec3，并主要定位于胞漿中。當給予NE刺激時，細胞中Sec3呈高表達狀態(tài)，并由胞漿轉(zhuǎn)移至胞膜。 (2)拴鏈因子Exocyst復合物的促黏液分泌效應 成功構(gòu)建了兩條特異性Sec3-shRNA，其中Sec3-shRNA1具備較理想的沉默效率。NE可促進MUC5AC mRNA和蛋白的表達增高，并呈劑量依賴性和時間依賴性增加。Sec3-shRNA可顯著阻斷NE誘導的MUC5AC蛋白胞內(nèi)高合成和胞外高分泌，但對MUC5AC mRNA高表達的抑制作用并不明顯。 (3)拴鏈因子Exocyst和皮層肌動結(jié)合蛋白Cortactin的促黏液分泌耦聯(lián)效應 Cortactin-shRNA可明顯抑制NE誘導的MUC5AC胞內(nèi)高表達和胞外高分泌，但對MUC5AC mRNA的高表達抑制作用不明顯。并且在聯(lián)合Cortactin-shRNA和Sec3-shRNA的雙重沉默作用情況下，不僅可明顯抑制NE誘導的MUC5AC胞內(nèi)合成，更可完全阻斷NE誘導的MUC5AC胞外分泌。免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)Sec3和Cortactin具有相互作用，在NE刺激時該相互作用明顯加強。細胞免疫熒光雙標發(fā)現(xiàn)明顯的重疊信號，具有明顯的共定位。 結(jié)論 (1) COPD患者支氣管上皮中Sec3呈高表達狀態(tài)，，并富集于靠管腔面細胞頂端； (2) NE可誘導16HBE細胞Sec3的高表達，并促其由胞漿向胞膜轉(zhuǎn)移； (3) NE可呈濃度依賴性和時間依賴性誘導MUC5AC基因和蛋白的高表達； (4) Sec3介導了NE誘導的MUC5AC蛋白胞內(nèi)高合成和胞外高分泌； (5) Sec3和Cortactin具有耦聯(lián)促黏液分泌效應，并基本掌控了MUC5AC的胞外分泌過程。
【關(guān)鍵詞】：氣道黏液高分泌 粘蛋白5AC 中性粒細胞彈性蛋白酶 Sec3/Exocyst拴鏈復合物 皮層肌動結(jié)合蛋白Cortactin
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R563.9
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 摘要7-11
• ABSTRACT11-15
• 前言15-20
• 參考文獻18-20
• 第一部分 人支氣管上皮和上皮細胞系拴鏈因子 Exocyst 的表達情況20-40
• 1 材料與方法20-31
• 2 結(jié)果31-35
• 3 討論35-38
• 參考文獻38-40
• 第二部分 拴鏈因子 Exocyst 對支氣管上皮細胞黏液高分泌行為的影響40-63
• 第一章 Sec3-shRNA 重組質(zhì)粒的構(gòu)建40-51
• 1 材料與方法40-47
• 2 結(jié)果47-51
• 第二章 Sec3 對氣道粘蛋白高分泌的調(diào)控作用51-59
• 1 材料與方法51-54
• 2. 結(jié)果54-59
• 討論59-61
• 參考文獻61-63
• 第三部分 拴鏈因子 Exocyst 與皮層肌動結(jié)合蛋白 Cortactin 在黏液高分泌中的耦聯(lián)效應63-74
• 1 材料與方法63-65
• 2 結(jié)果65-70
• 3 討論70-72
• 參考文獻72-74
• 全文總結(jié)74-75
• 文獻綜述75-87
• 參考文獻83-87
• 致謝87-88
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的論文目錄88-89

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1 劉春漪;拴鏈因子Exocyst與皮層肌動結(jié)合蛋白Cortactin在黏液高分泌中的耦聯(lián)效應[D];重慶醫(yī)科大學;2014年

本文編號：690131