本文關(guān)鍵詞：香煙煙霧提取物對(duì)RLE-6TN細(xì)胞的損傷以及蘿卜硫素和N-乙酰半胱氨酸的保護(hù)作用

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【摘要】：研究背景：香煙煙霧作為慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素,其對(duì)上皮細(xì)胞的損傷是通過多種復(fù)雜機(jī)制產(chǎn)生的,其中氧化應(yīng)激是重要的部分。蘿卜硫素(sulforaphane, SFN)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的保護(hù)作用是通過激活Nrf2-ARE信號(hào)通路進(jìn)而實(shí)現(xiàn)的抗氧化保護(hù)作用,N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)作為一種已知抗氧化作用明確的保護(hù)劑,在本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行使用。 研究目的：觀察SFN對(duì)于在香煙煙霧刺激下RLE-6TN細(xì)胞的保護(hù)作用及初步探討其機(jī)制,并進(jìn)一步觀察NAC對(duì)RLE-6TN細(xì)胞的保護(hù)作用。 研究方法：選用RLE-6TN細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng),分成如下4組：不經(jīng)處理的對(duì)照組(control),只加入5%香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract, CSE)的5%CSE組,經(jīng)過0.5μM SFN預(yù)處理12小時(shí)后再加入5%CSE的SFN+5%CSE組以及同時(shí)加入lmMNAC和5%CSE的NAC+5%CSE組。使用MTT法檢測不同濃度的香煙煙霧提取物以及蘿卜硫素對(duì)細(xì)胞活性的影響。使用Hoechst33258進(jìn)行細(xì)胞核染色觀察形態(tài)改變。使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況,周期改變以及使用DCFH-DA探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。使用RT-PCR法和Western Blot法分別檢測Nrf2在mRNA以及蛋白水平的表達(dá)。另外使用RT-PCR法檢測了與細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡相關(guān)的細(xì)胞因子IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-5以及P53、P21的mRNA表達(dá)情況。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)MTT法的檢測結(jié)果,我們選用5%CSE作為對(duì)RLE-6TN細(xì)胞的刺激的損傷濃度,用0.5μM的SFN對(duì)細(xì)胞進(jìn)行12小時(shí)的預(yù)處理。通過流式細(xì)胞術(shù),觀察到CSE的刺激使RLE-6TN細(xì)胞周期發(fā)生G1期阻滯,而在SFN預(yù)處理組和NAC處理組,阻滯現(xiàn)象得到緩解；SFN和NAC能分別使CSE導(dǎo)致的RLE-6TN細(xì)胞凋亡現(xiàn)象(%)由78.08±0.97降低至6.12±0.33和12.35±1.16,并使CSE刺激下細(xì)胞內(nèi)活性氧水平(%)由86.63±1.21降低至28.03±0.26和58.27±2.77。根據(jù)RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SFN能夠明顯促進(jìn)Nrf2mRNA的表達(dá),與對(duì)照組相比增高達(dá)8倍；同時(shí)Western Blot結(jié)果提示SFN和NAC均可促進(jìn)Nrf2在蛋白水平的表達(dá)。根據(jù)RT-PCR法對(duì)IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-5以及P53、P21在mRNA水平表達(dá)情況的檢測結(jié)果表明,當(dāng)RLE-6TN細(xì)胞受到CSE的氧化損傷刺激后,IGFBP-3、IGFBP-5和P53的mRNA表達(dá)上升有顯著性意義,而通過SFN的預(yù)處理后,IGFBP-5mRNA的表達(dá)與香煙組對(duì)比有顯著性差異,經(jīng)過NAC的保護(hù)后,IGFBP-3、IGFBP-5和P53的mRNA表達(dá)均顯著性降低。 結(jié)論：香煙煙霧提取物對(duì)RLE-6TN細(xì)胞造成的損傷呈現(xiàn)毒性劑量依賴關(guān)系,引起細(xì)胞活性氧含量明顯增高,并造成細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。而SFN和NAC能夠有效降低細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,緩解由于CSE刺激所造成的細(xì)胞周期阻滯,并拮抗細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)理可能與促進(jìn)Nrf2的高表達(dá)有關(guān)。此外,SFN和NAC均可減低CSE刺激下增高的IGFBP-3、IGFBP-5和P53的mRNA表達(dá)水平,提示SFN和NAC還有可能通過對(duì)上述因子的調(diào)節(jié)來促進(jìn)細(xì)胞增殖和損傷修復(fù)。
【關(guān)鍵詞】：香煙煙霧提取物 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞 蘿卜硫素 Nrf2 N-乙酰半胱氨酸
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R563.9
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 主要英文縮寫詞中英文對(duì)照表7-8
• 目錄8-10
• 前言10-12
• 第一章 香煙煙霧提取物對(duì)RLE-6TN細(xì)胞的損傷,蘿卜硫素和N-乙酰半胱氨酸的保護(hù)作用以及與Nrf2的關(guān)系12-37
• 1 材料與方法12-20
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器12-13
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑13
• 1.3 細(xì)胞培養(yǎng)13
• 1.4 香煙煙霧提取物的制備13-14
• 1.5 MTT法檢測香煙煙霧提取物(CSE)毒性14
• 1.6 MTT法檢測蘿卜硫素(SFN)毒性14
• 1.7 細(xì)胞周期分析14-15
• 1.8 細(xì)胞凋亡檢測15
• 1.9 Hoechst 33258染色15
• 1.10 ROS水平檢測15-16
• 1.11 RT-PCR法檢測Nrf2,IGFBP-2,IGFBP-3,IGFBP-5以及P53和P21的mRNA16-18
• 1.12 Western blot法檢測Nrf2的蛋白水平18-20
• 1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析20
• 2 結(jié)果20-32
• 3 討論32-34
• 4 結(jié)論34-35
• 參考文獻(xiàn)35-37
• 第二章 綜述：肺泡巨噬細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子與慢性阻塞性肺疾病相互關(guān)系研究進(jìn)展37-45
• 摘要37
• Abstract37-38
• 慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)38-39
• 一、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)39-40
• 二、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)40-41
• 三、腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor-a,TNF-a)41
• 四、其他相關(guān)因子41-42
• 小結(jié)42-43
• 參考文獻(xiàn)43-45
• 攻讀碩士研究生期間研究成果45-46
• 致謝46-47

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：674218