本文關(guān)鍵詞：香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的小鼠肺部損傷模型中嗜酸性粒細(xì)胞的作用研究

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【摘要】：慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病,表現(xiàn)為持續(xù)的氣道炎癥細(xì)胞浸潤、不完全可逆的氣流受限、粘液過度分泌和氣道重構(gòu)等特征。眾所周知,吸煙是引發(fā)COPD的最為重要的危險因素,然而,其機制目前仍未完全闡明。一種為大家廣泛接受的觀點是局部免疫失調(diào)是COPD發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)。臨床研究結(jié)果顯示Tel與Thl7細(xì)胞與COPD的關(guān)系較為密切。動物實驗也證實,Th1和Th17細(xì)胞在吸煙誘導(dǎo)的肺部炎癥中起重要作用。 COPD的一個重要特征是持續(xù)的炎癥反應(yīng),包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。目前,嗜酸性粒細(xì)胞在COPD中的作用并不明確。盡管嗜酸性粒細(xì)胞通常與過敏性疾病(如支氣管哮喘)和寄生蟲感染的關(guān)系較為密切,但是臨床研究表明,部分COPD患者外周血和／或誘導(dǎo)痰標(biāo)本中嗜酸性粒細(xì)胞的比例有明顯上升。COPD的治療常常用到糖皮質(zhì)激素,而其療效往往不盡如人意。然而,嗜酸性粒細(xì)胞比例較高的患者對激素的反應(yīng)較好。這一現(xiàn)象提示,嗜酸性粒細(xì)胞至少在部分COPD患者的發(fā)病過程起作用。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為,嗜酸性粒細(xì)胞作為一種終末分化的細(xì)胞,通過脫顆粒過程釋放一些炎癥介質(zhì),在固有免疫過程中發(fā)揮作用。近年來的研究則表明,嗜酸性粒細(xì)胞對于適應(yīng)性免疫反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用。在嗜酸性粒細(xì)胞缺失的小鼠體內(nèi)Th2型免疫反應(yīng)明顯受到抑制,而且不能通過過繼活化的DC來重建。只有同時過繼嗜酸性粒細(xì)胞和活化的DC才能重建Th2型免疫反應(yīng)和氣道炎癥。COPD是一種以Th1, Th17型免疫反應(yīng)占優(yōu)勢的疾病,那么嗜酸性粒細(xì)胞細(xì)胞是否也能調(diào)控Th1, Th17的作用進而改變氣道炎癥反應(yīng)? 針對以上假設(shè),我們利用嗜酸性粒細(xì)胞缺失的小鼠(PHIL),將其與WT小鼠共同暴露于香煙煙霧中,觀察氣道炎癥反應(yīng),肺部和脾臟的T細(xì)胞亞群的變化。結(jié)果顯示,與WT小鼠相比,PHIL小鼠的氣道炎癥明顯較弱,肺部和脾臟的Th17/Tc17細(xì)胞的比例下降,但是對Th1/Tc1的比例并無明顯影響。與此同時,PHIL小鼠BALF和肺組織勻漿的IFN-γ的濃度明顯上升,而IL-17A的水平僅有微弱的上升。我們的研究結(jié)果表明,嗜酸性粒細(xì)胞通過Th17/Tc17細(xì)胞來調(diào)控吸煙誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)。 第一部分煙霧暴露誘導(dǎo)的小鼠肺部損傷模型的建立 目的：建立煙霧暴露誘導(dǎo)的小鼠肺部損傷模型,觀察小鼠在煙霧暴露下氣道炎癥以及T細(xì)胞免疫反應(yīng)的動態(tài)變化。 方法：將183只C57BL/6小鼠(雄性,8-10周)隨機分為兩組,93只吸煙組小鼠置于全身暴露裝置中,給予煙霧暴露(100支煙／天,5天/周),其余90只對照組小鼠暴露于空氣中。在兩組下面,根據(jù)暴露時間再分為6個亞組,暴露時間設(shè)定為1周,2周,4周,8周,12周和24周。在每一個時間點,處理相應(yīng)亞組的小鼠。一部分小鼠左肺取支氣管肺泡灌洗液(BALF),進行細(xì)胞總數(shù)與分類的計數(shù),然后用4%多聚甲醛固定,制成病理切片觀察炎癥浸潤與肺氣腫形成情況；取右肺用于提取mRNA和蛋白,用定熒光量PCR和ELISA法檢測相關(guān)分子的表達(dá)和分泌。另一部分小鼠的雙肺,剪碎后經(jīng)膠原酶消化,研磨制成細(xì)胞懸液,然后用淋巴細(xì)胞分離液分離得到單個核細(xì)胞懸液,經(jīng)過刺激后以流式細(xì)胞術(shù)檢測肺組織中各個T細(xì)胞亞型的變化。脾臟直接研磨后制成細(xì)胞懸液經(jīng)過刺激后以流式細(xì)胞術(shù)檢測肺組織中各個T細(xì)胞亞型的變化。 結(jié)果：煙霧暴露使小鼠肺部有大量炎癥細(xì)胞浸潤,早期主要聚集于大氣道周圍,隨著暴露時間的延長,小氣道周圍也有大量炎癥細(xì)胞浸潤。煙霧暴露12周炎癥反應(yīng)最為明顯,煙霧暴露組的炎癥評分遠(yuǎn)高于對照組(2.250.22vs.1.00±0.21,P0.001)。煙霧暴露24周后,雖然炎癥反應(yīng)有所減輕,然而肺泡內(nèi)襯間隔(MLI)明顯增大(94.38±6.45vs.70.20±4.45μm, P0.05),肺氣腫形成。煙霧暴露極大地增加了BALF中細(xì)胞的數(shù)量,巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量都有明顯的上升。其中,中性粒細(xì)胞的變化最為明顯,其峰值出現(xiàn)在12周((2.77±1.07)×104/ml vs.(9.75±1.60)×104/ml, P0.01).中長期煙霧暴露使肺部Tcl,Th17以及Tc17細(xì)胞的比例明顯上升,同樣在12周最為明顯(Tcl:(43.63±3.25)％vs.(56.58±2.28)％, P0.05:Th17:(11.25±1.92)％vs.(19.58±2.31)％, P0.05； Tc17:(5.96±0.17)％vs.(8.53±0.78)％, P0.05).與肺部的情況相似,煙霧暴露也能使脾臟的Tcl,Thl7以及Tc17細(xì)胞擴增。煙霧暴露明顯地提高了肺組織IFN-γ和IL-17A的表達(dá)水平(12周達(dá)到最高水平,分別達(dá)到13.46倍和12.13倍),同時也使兩者在BALF和肺組織勻漿中的含量上升。此外,煙霧暴露顯著地提高了肺組織中趨化因子(CCL2,CXCL1和CXCL2)和前炎癥因子(IL-6,TNF-α和IL-1β)的表達(dá)水平。 結(jié)論：煙霧暴露能夠先后引發(fā)小鼠肺部炎癥以及肺氣腫,且在不同階段病理改變不盡一致。中長期煙霧暴露誘導(dǎo)Tc1.Th17以及Tc17三種T細(xì)胞亞群的增殖,不僅改變了局部T細(xì)胞亞群的比例,而且對遠(yuǎn)隔部位的T細(xì)胞亞群也有明顯的影響。 第二部分嗜酸性粒細(xì)胞在香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的小鼠肺部損傷模型中的作用 目的：觀察嗜酸性粒細(xì)胞在煙霧暴露模型中對小鼠氣道炎癥以及T細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響。 方法：將同窩生的WT與PHIL小鼠隨機分為對照組(WT/CON,PHIL/CON)和煙霧暴露組(WT/CS,PHIL/CS),利用前一部分的方法構(gòu)建動物模型,共暴露12周。一部分小鼠左肺取支氣管肺泡灌洗液(BALF),進行細(xì)胞總數(shù)與分類的計數(shù),然后用4%多聚甲醛固定,制成病理切片觀察炎癥浸潤與肺氣腫形成情況；取右肺用于提取mRNA和蛋白,用定熒光量PCR和ELISA法檢測相關(guān)分子的表達(dá)和分泌。另一部分小鼠的雙肺,剪碎后經(jīng)膠原酶消化,研磨制成細(xì)胞懸液,然后用淋巴細(xì)胞分離液分離得到單個核細(xì)胞懸液,經(jīng)過刺激后以流式細(xì)胞術(shù)檢測肺組織中各個T細(xì)胞亞型的變化。脾臟直接研磨后制成細(xì)胞懸液經(jīng)過刺激后以流式細(xì)胞術(shù)檢測肺組織中各個T細(xì)胞亞型的變化。 結(jié)果：煙霧暴露后,PHIL/CS組的炎癥浸潤程度低于WT/CS組(1.67±0.22vs.2.50±0.29),但尚未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。兩者的肺泡內(nèi)襯間隔(MLI)也無明顯差別。WT/CS組和PHIL/CS組BALF中細(xì)胞總數(shù)均較相應(yīng)的對照組升高,但是WT/CS組的BALF細(xì)胞總數(shù)明顯高于PHIL/CS組((54.25±2.41)×104/ml vs.(30.22±2.99)×104/ml,P0.001).除細(xì)胞總數(shù)以外,WT/CS組的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量均高于PHIL/CS組(巨噬細(xì)胞：(42.47±1.71)×104/ml vs.(25.75±2.39)×104/ml, P0.001；中性粒細(xì)胞：(6.59±1.32)×104/ml vs.(2.34±0.63)×104/ml,P0.01:淋巴細(xì)胞：(5.18±0.65)×104/m1vs.(2.33±0.42)×104/ml, P0.001).與WT/俐CS組相比,PHIL/CS組肺部Th17與Tc17細(xì)胞比例明顯降低(Th17:(4.31±0.36)％vs.(8.44±0.56)％, P0.01； Tcl7:(4.66±0.73)％vs.(10.43±0.51)％, P0.01).同時,PHIL/CS組脾臟Th17與Tc17細(xì)胞比例也低于WT/CS組(Th17:(1.15±0.20)％vs.(2.13±0.31)％, P0.05:Tcl7:(0.80±0.08)％vs.(1.66±0.34)％, P0.05).但是,無論是在肺部還是脾臟,WT/CS組和PHIL/CS組Thl和Tc1的比例無明顯區(qū)別。WT/CS組IL-17A的mRNA水平(9.55vs.4.72倍)和蛋白水平均高于PHIL/CS組(BALF:31.06±4.36vs.16.96±2.18pg/ml,P0.01；肺組織勻漿：11.11±0.86vs.5.77±1.10pg/mg protein,P0.001),而兩組間IFN-γ的水平相差無幾。多種趨化因子(CCL2, CXCL1,CXCL2)及部分炎癥因子(IL-6)在WT/CS組的表達(dá)水平均高于PHIL/CS組。另有一些趨化因子(CXCL5)和炎癥因子(TNF-α和IL-1β)在兩組間的表達(dá)水平相當(dāng)。 結(jié)論：嗜酸性粒細(xì)胞缺失能夠減輕香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的氣道炎癥,但是不能明顯改變肺氣腫的形成。嗜酸性粒細(xì)胞正向調(diào)控Th17/Tc17介導(dǎo)的免疫反應(yīng),但是對Th1/Tc1細(xì)胞亞群并無明顯影響。 第三部分嗜酸性粒細(xì)胞調(diào)控氣道炎癥及T細(xì)胞免疫反應(yīng)的機制研究 目的：從氣道上皮細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞兩方面探討嗜酸性粒細(xì)胞缺失減輕炎癥以及T細(xì)胞免疫反應(yīng)的可能機制方法：從WT和PHIL小鼠中提取原代氣道上皮細(xì)胞(MTEC),經(jīng)氣液相培養(yǎng)后,用2%CSE干預(yù),并設(shè)立一系列時間點,包括0,3,6,12和24小時。干預(yù)完畢后,檢測兩種小鼠來源的MTEC中各種趨化因子和細(xì)胞因子表達(dá)水平。仍然利用第一部分所建立的模型,將兩種小鼠暴露于煙霧中。暴露時間8周。暴露結(jié)束后,取小鼠的肺組織,剪碎后經(jīng)膠原酶消化,研磨制成細(xì)胞懸液,然后用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞,以流式細(xì)胞術(shù)檢測肺組織中DC以及共刺激分子數(shù)量和比例。結(jié)果：以2%香煙煙霧提取物(CSE)刺激來源于兩種小鼠的原代氣道上皮細(xì)胞,各種因子的表達(dá)隨著刺激時間的延長呈動態(tài)的變化。經(jīng)過CSE處理后,各種因子在WT來源的MTEC中的表達(dá)水平高于PHIL來源的MTEC.其中CXCL2,CCL2,IL-6的表達(dá)在兩種細(xì)胞間相差尤為明顯(CXCL2:8.22vs.3.04倍,P0.05；CCL2:13.06vs.0.60倍,P0.001:IL-6:7.24vs.0.77倍, P0.01)。煙霧暴露并未改變肺部DC的比例,但是能顯著降低兩種小鼠MHC分子的表達(dá)(MHC Ⅰ:3.340±0.036vs.2.965±0.027,P0.001(WT),3.424±0.049vs.3.007±0.012, P0.001(PHIL)；MHCⅡ:3.395±0.079vs.2.721±0.079,P0.001(WT),3.432±0.100vs.3.010±0.072,P0.01(PHIL)).同時,煙霧暴露也使共刺激分子的表達(dá)降低,該現(xiàn)象在WT小鼠體內(nèi)更為明顯(CD80:2.881±0.027vs.2.727±0.048,P0.01:CD86:3.050±0.023vs.2.957±0.015,P0.05). 結(jié)論：PHIL小鼠氣道上皮細(xì)胞對香煙煙霧提取物的反應(yīng)弱于WT小鼠,嗜酸性粒細(xì)胞在該模型中并未影響DC的成熟與活化過程。
【關(guān)鍵詞】：香煙煙霧 T細(xì)胞 氣道上皮細(xì)胞 嗜酸性粒細(xì)胞 肺部損傷
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R563.9;R-332
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-11
• Abstract11-17
• 縮略語中英文對照17-20
• 第一部分 煙霧暴露誘導(dǎo)的小鼠肺部損傷模型的建立20-56
• 1.1 引言20-21
• 1.2 材料和方法21-32
• 1.3 結(jié)果32-50
• 1.4 討論50-54
• 1.5 小結(jié)54-56
• 第二部分 嗜酸性粒細(xì)胞在香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的小鼠肺部損傷模型中的作用56-82
• 2.1 引言56
• 2.2 材料和方法56-58
• 2.3 結(jié)果58-78
• 2.4 討論78-81
• 2.5 小結(jié)81-82
• 第三部分 嗜酸性粒細(xì)胞調(diào)控氣道炎癥及T細(xì)胞免疫反應(yīng)的機制研究82-95
• 3.1 引言82-83
• 3.2 材料和方法83-88
• 3.3 結(jié)果88-91
• 3.4 討論91-94
• 3.5 小結(jié)94-95
• 結(jié)論95-96
• 參考文獻96-115
• 綜述115-124
• 參考文獻120-124
• 作者簡歷及在學(xué)期間的科研成果124

【共引文獻】

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本文編號：650332