發(fā)布時間：2017-08-06 23:03

  本文關(guān)鍵詞：肺臟來源的exosome參與肺臟免疫平衡維持的功能及其機(jī)制研究

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【摘要】：人體每天經(jīng)呼吸道吸入大量外界環(huán)境中的抗原性物質(zhì),而進(jìn)入呼吸道系統(tǒng)中的各種外界環(huán)境抗原均有可能誘發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生強烈的排異反應(yīng)。然而正常情況下,呼吸道卻始終能夠處于一種相對的免疫平衡狀態(tài),說明肺臟可以通過某些精細(xì)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)對外來抗原的免疫耐受,從而維持肺臟的相對免疫平衡狀態(tài)。隨著人類長期的進(jìn)化,我們的免疫系統(tǒng)逐漸形成了幾種有效的方式維持機(jī)體對一些外來無害抗原的免疫耐受,包括克隆失能、克隆忽略和通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌IL-10及TGF-β1等抑制性細(xì)胞因子防止免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化等。而一旦肺臟免疫耐受平衡被打破會導(dǎo)致呼吸道相關(guān)的自身免疫性疾病,比如哮喘。哮喘是最常見的呼吸道免疫失衡性疾病之一,目前認(rèn)為Th1/Th2細(xì)胞之間平衡的紊亂是哮喘最主要的發(fā)病機(jī)制,免疫失衡是哮喘重要的發(fā)病基礎(chǔ),而對呼吸道免疫耐受形成機(jī)制的深入研究也可以為哮喘的治療提供新的思路。Exosome是各種活細(xì)胞分泌的具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的小囊泡,其直徑主要介于30-100 nm之間,密度范圍從1.12g/ml到1.21 g/ml。目前已經(jīng)有很多文獻(xiàn)證實, exosome在促進(jìn)免疫反應(yīng)和抑制免疫反應(yīng)中扮演著重要作用,本課題中exosome的來源為小鼠肺臟組織,我們探討肺臟組織來源的exosome是否參與了肺臟免疫耐受的維持,通過建立哮喘動物模型來驗證我們的這一猜想,從而為呼吸道免疫耐受失衡相關(guān)疾病提供新的思路。首先我們對肺臟來源的exosome (exosome from lung, L-EXO)進(jìn)行鑒定,電鏡結(jié)果表明我們提取的L-EXO直徑一般在30-100 nm之間,通過密度梯度離心密度范圍為1.09 g/ml到1.17 g/ml之間,且表達(dá)CD63、TSG101和HSP70等exosome標(biāo)志性蛋白,而不表達(dá)質(zhì)膜相關(guān)蛋白GRP94。此外,L-EXO還表達(dá)免疫抑制分子TGF-β1和IL-10。我們發(fā)現(xiàn)L-EXO能在體外明顯抑制CD4+T細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生,采用TGF-β1受體阻斷我們發(fā)現(xiàn)L-EXO對CD4+T細(xì)胞增殖抑制的能力幾乎消失了,說明L-EXO具有免疫抑制功能依賴于TGF-β1。接著,我們探討了L-EXO的具體來源細(xì)胞。L-EXO表面表達(dá)CD8、CDllc和SPB (surfactant protein B),采用磁珠分選的方法分選出CDllc陽性和CD8陽性的L-EXO,我們發(fā)現(xiàn)分選的CDllc陽性的L-EXO同時表達(dá)CD8；反之亦然。而且只有該群L-EXO具有抑制CD4+T細(xì)胞的增殖的能力,說明具有免疫抑制功能的L-EXO是來源于CD8陽性的樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)。體內(nèi)實驗部分我們采用OVA誘導(dǎo)的小鼠急性哮喘模型,探討我們分離出來的L-EXO是否參與肺臟免疫耐受的維持,通過尾靜脈回輸L-EXO后分析肺泡灌洗液的細(xì)胞成分、各種細(xì)胞因子和肺臟病理變化,我們發(fā)現(xiàn)L-EXO對哮喘癥狀有一定的緩解效應(yīng),根據(jù)之前的分選L-EXO亞群的結(jié)果我們分選出CD11c+ L-EXO回輸小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)對哮喘的緩解效果更好,所以體內(nèi)體外結(jié)果均提示我們L-EXO對哮喘的癥狀有一定程度的緩解。接下來我們想知道L-EXO對哮喘的緩解作用是否依賴于TGF-β1。體內(nèi)實驗結(jié)果表明回輸正常小鼠L-EXO后,Smad3+/.小鼠哮喘緩解效果較對照野生型C57小鼠差,但L-EXO對Smad3+/.小鼠的哮喘仍具有一定的緩解作用。鑒于,我們在L-EXO中同時還發(fā)現(xiàn)較高水平的IL-10。因此,我們進(jìn)一步評價L-EXO攜帶的IL-10是否參與其對小鼠哮喘的緩解作用。我們分選了IL-10-/-小鼠的L-EXO回輸給C57小鼠,雖然具有緩解哮喘的效果,但與正常小鼠來源的L-EXO相比,其作用要明顯削弱,這些實驗數(shù)據(jù)提示L-EXO依賴于TGF-β1和IL-10維持呼吸道的免疫耐受。為進(jìn)一步明確L-EXO在維持呼吸道免疫耐受中的作用,我們采用中性鞘磷脂酶小干擾RNA敲低3LL肺癌細(xì)胞中Smpd3的表達(dá),并證實了當(dāng)Smpd3的表達(dá)被被抑制之后,可明顯抑制exosome的分泌。之后,體內(nèi)也驗證了當(dāng)給予小鼠鼻飼滴入Smpd3干擾慢病毒后小鼠肺臟分泌exosome的量減少,同時我們可以觀察到,OVA誘導(dǎo)的小鼠急性哮喘癥狀明顯加強,而外源性回輸L-EXO后小鼠的哮喘癥狀可以得到緩解,表明L-EXO參與了呼吸道免疫耐受的維持。綜上,在本課題的研究中,我們發(fā)現(xiàn)L-EXO具有免疫抑制功能,能夠通過其攜帶的TGF-p11和IL-10緩解OVA誘導(dǎo)的小鼠急性哮喘,而生理存在的L-EXO對老鼠哮喘的癥狀具有重要的影響。我們的研究結(jié)果為解釋肺臟免疫耐受提供了一種新的機(jī)制,同時也提示我們可以通過增加L-EXO的分泌治療哮喘等呼吸道系統(tǒng)免疫失衡相關(guān)疾病。
【關(guān)鍵詞】：肺臟免疫耐受 Exosome TGF-β1 哮喘
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R562.25
【目錄】：

• 致謝4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 縮略詞表12-14
• 1 引言14-16
• 2 材料與方法16-24
• 2.1 實驗材料16-18
• 2.2 實驗方法18-24
• 3 實驗結(jié)果24-54
• 3.1 小鼠肺臟能夠分泌exosome24-27
• 3.2 肺來源的exosome具有抑制CD4~+T細(xì)胞增殖的功能27-34
• 3.3 L-EXO通過TGF-β1緩解OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘的癥狀34-45
• 3.4 L-EXO通過IL-10緩解OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘的癥狀45-47
• 3.5 抑制體內(nèi)exosome的分泌會增加小鼠對OVA誘導(dǎo)的急性哮喘的易感性47-54
• 4 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-56
• 綜述56-78
• 參考文獻(xiàn)65-78
• 作者簡歷78

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