本文關(guān)鍵詞：單壁碳納米管暴露致肺免疫毒性介導(dǎo)凝血纖溶系統(tǒng)改變的間接毒性作用研究

  更多相關(guān)文章： 單壁碳納米管 血管內(nèi)皮功能紊亂 炎性因子 凝血纖溶活化因子 間接毒性

【摘要】：納米材料具有特殊的物理、化學(xué)性質(zhì),因而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、電子、化工、環(huán)保等諸多領(lǐng)域。進入環(huán)境的納米材料正在成為一類新型污染物,對人類的健康構(gòu)成現(xiàn)實威脅。目前,很多國家就納米材料安全性問題,展開了多種項目和計劃,其目的是控制納米技術(shù)的風(fēng)險性。開展納米材料生物安全性的基礎(chǔ)研究,建立納米材料生物安全性評價的關(guān)鍵技術(shù),是促進納米材料合理利用的必然要求,具有重大科學(xué)意義和社會效益。納米材料進入人體的主要途徑之一是呼吸道的暴露。大量流行病學(xué)及實驗研究證明,吸入污染空氣中的顆粒物可導(dǎo)致心血管疾病發(fā)病率和死亡率增加。其中,納米顆粒物即超細顆粒物,可能在大氣顆粒物誘發(fā)心血管疾病方面起主要作用。到目前為止,依然缺乏有關(guān)納米顆粒物經(jīng)呼吸道吸入后誘發(fā)心血管毒性效應(yīng)的系統(tǒng)性研究資料,其背后可能的作用機制仍未完全闡明。作為一種典型的納米材料,單壁碳納米管(single-walled carbon nanotube,SWCNT)已經(jīng)成為納米科技發(fā)展中應(yīng)用最廣泛的材料之一�，F(xiàn)有的關(guān)于SWCNT的毒性研究,多數(shù)集中在SWCNT對組織、臟器及細胞造成的直接損傷方面,對SWCNT通過影響呼吸系統(tǒng)免疫毒性而發(fā)揮間接的心血管毒性效應(yīng)尚未進行深入的研究。目的1.研究SWCNT經(jīng)呼吸道暴露后,機體凝血纖溶系統(tǒng)包括脈管系統(tǒng)的變化,闡明該變化與肺臟出現(xiàn)的免疫毒性反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)性。2.探討SWCNT暴露致肺免疫毒性在介導(dǎo)凝血纖溶系統(tǒng)改變中的間接毒性作用及可能的作用機制。方法在整體動物實驗中,選取雄性Wistar大鼠采用非暴露式氣管滴注方式染毒,隔日染毒一次,分別暴露30天和60天。HE染色法觀察各組大鼠肺組織病理學(xué)變化;ELISA法檢測大鼠肺組織、血漿中幾種炎性因子表達水平,包括白介素-1α(IL-1α)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。同時檢測血漿中凝血纖溶相關(guān)因子的變化,包括:組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、纖溶酶原活化劑抑制物-1(PAI-1)、D-二聚體(D-dimer)、內(nèi)皮素(ET-1)、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)、一氧化氮(NO)以及血管性血友病因子(v WF)。透射電鏡觀察大鼠胸主動脈血管內(nèi)膜的損傷情況;免疫組化法檢測血管內(nèi)皮相關(guān)因子的表達;RT-PCR法檢測血液中m RNA的表達。在體外細胞實驗中,分別培養(yǎng)大鼠肺泡巨噬細胞株及原代大鼠主動脈血管內(nèi)皮細胞,以肺泡巨噬細胞作為效應(yīng)細胞,血管內(nèi)皮細胞作為靶細胞,建立體外炎性因子刺激模型和細胞間接暴露模型。觀察SWCNT染毒后細胞形態(tài)學(xué)變化;CCK-8法檢測細胞活性;ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液上清中炎性因子及凝血纖溶活化因子表達水平;流式細胞儀檢測ROS水平的變化;Western blot檢測血管內(nèi)皮細胞相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果一、整體動物實驗1.肺免疫毒性損傷:SWCNT經(jīng)呼吸道分別暴露30天和60天后,大鼠肺部出現(xiàn)病理性改變,局部可見不同程度的棕黑色顆粒物沉積、肺部間質(zhì)性炎癥;肺組織表達炎性因子IL-1α、IL-6、TNF-α水平與正常對照組相比顯著增加,提示肺組織出現(xiàn)炎性免疫反應(yīng)。2.血液系統(tǒng)變化:(1)SWCNT經(jīng)呼吸道暴露30天和60天后,大鼠出現(xiàn)不同程度的全身系統(tǒng)性炎癥,表現(xiàn)為血漿中炎性因子IL-1α、IL-6、TNF-α水平升高、白細胞(WBC)、血小板(PLT)釋放增多;同時,血漿粘稠度升高、血中纖維蛋白原(FIB)含量增加。(2)大鼠血漿中凝血纖溶活化因子測定結(jié)果顯示,血管內(nèi)皮細胞分泌、合成或釋放AT-Ш、t-PA、TM等因子減少,而合成v WF、TF、ET-1增多,提示血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮凝血和抗凝功能紊亂,甚至血管內(nèi)皮損傷。3.血管內(nèi)皮系統(tǒng)的損傷:(1)SWCNT暴露60天后,染毒組大鼠血管內(nèi)膜層出現(xiàn)細胞核畸形、核質(zhì)固縮等異常改變,結(jié)合病理檢查發(fā)現(xiàn)染毒60天,高劑量組大鼠血管內(nèi)皮細胞周圍有炎細胞浸潤,這些結(jié)果提示血管內(nèi)膜受到刺激,并且發(fā)生不同程度的損傷。(2)SWCNT暴露30天和60天后,血管內(nèi)皮表達t-PA抗原明顯降低,同時中、高劑量組大鼠血管內(nèi)膜表達v WF顯著升高,進一步表明并驗證大鼠血管內(nèi)皮細胞的抗血栓功能減弱、內(nèi)皮細胞發(fā)生損傷。4.外周血相關(guān)基因的表達:SWCNT暴露60天后,高劑量組大鼠外周血中t-PA基因表達明顯降低而TM基因表達明顯升高,提示它們可能成為SWCNT呼吸道暴露所致大鼠凝血纖溶功能紊亂較為敏感的生物標志基因。同時,高劑量組p38MAPK基因表達亦明顯升高,提示p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能是參與SWCNT所致機體凝血纖溶活化因子改變的主要作用機制之一。二、體外細胞試驗1.SWCNT對大鼠肺泡巨噬細胞的影響:(1)大鼠肺泡巨噬細胞經(jīng)SWCNT暴露48 h,可見細胞吞噬納米顆粒物質(zhì),胞漿內(nèi)出現(xiàn)黑色顆粒,隨著染毒劑量的增加,這種吞噬作用越發(fā)明顯,表現(xiàn)為巨噬細胞聚集并吞噬納米顆粒,當(dāng)染毒劑量大于50μg/m L時,巨噬細胞聚集成團狀,胞漿內(nèi)幾乎充滿黑色納米顆粒,當(dāng)染毒劑量達到200μg/m L時,細胞死亡增加,細胞數(shù)量明顯減少。(2)隨著SWCNT暴露劑量的增加和暴露時間的延長,肺泡巨噬細胞活性呈降低趨勢。與正常對照組相比,SWCNT暴露24 h、48 h和72 h后,50,100,200μg/m L SWCNT染毒組的細胞活性明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。(3)暴露于75μg/m L和100μg/m L的SWCNT染毒液96 h后,大鼠肺泡巨噬細胞活性氧水平高于正常對照組,其中,SWCNT 100μg/m L組活性氧水平與對照組相比顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。該結(jié)果提示SWCNT可通過氧化應(yīng)激方式,對大鼠肺泡巨噬細胞造成毒性損傷。(4)大鼠肺泡巨噬細胞在SWCNT的刺激下,能夠持續(xù)分泌前炎癥因子IL-1α、IL-6以及TNF-α。隨著暴露時間的延長和染毒劑量的增加,炎性因子IL-1α分泌水平呈增加趨勢。與正常對照組相比,SWCNT 50,75,100μg/m L染毒組分別暴露24 h、48 h和96 h后,細胞分泌IL-1α水平均顯著高于正常對照組;SWCNT 50,75,100μg/m L染毒組分別暴露24 h和48 h后,細胞分泌IL-6水平均顯著高于正常對照組;SWCNT 75,100μg/m L染毒組分別暴露48 h和96 h后,細胞分泌TNF-α水平均顯著高于正常對照組,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。2.炎性因子對大鼠血管內(nèi)皮細胞分泌凝血纖溶相關(guān)因子的影響:利用炎性因子TNF-α刺激大鼠血管內(nèi)皮細胞后,內(nèi)皮細胞分泌凝血纖溶相關(guān)因子發(fā)生改變,主要表現(xiàn)為AT-Ш、t-PA分泌減少,v WF、TF、PAI-1釋放增多,提示血管內(nèi)皮細胞功能受到影響。3.大鼠肺泡巨噬細胞介導(dǎo)的SWCNT間接暴露對大鼠血管內(nèi)皮細胞功能的影響及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路:(1)血管內(nèi)皮細胞經(jīng)間接暴露模型處理后,各組細胞分泌t-PA的水平均顯著低于正常對照組和SWCNT直接暴露組;而各組細胞分泌PAI-1的水平雖與正常對照組相比顯著升高,但與SWCNT直接暴露組相比,不具有顯著性差異。SWCNT暴露劑量為100μg/m L時,經(jīng)間接暴露模型處理的RAECs組分泌TF水平顯著高于正常對照組和SWCNT直接暴露組。SWCNT暴露劑量為25和100μg/m L時,經(jīng)間接暴露模型處理后的RAECs分泌AT-Ш的水平與正常對照組和SWCNT直接暴露組相比,均顯著降低。提示肺泡巨噬細胞對血管內(nèi)皮細胞具有一定的介導(dǎo)作用,能夠?qū)е卵軆?nèi)皮細胞功能的變化。(2)Western blot試驗結(jié)果顯示,經(jīng)間接暴露模型處理后的各組血管內(nèi)皮細胞表達t-PA蛋白的水平明顯低于正常對照組,當(dāng)SWCNT暴露劑量為75和100μg/m L時,內(nèi)皮細胞表達JNK蛋白的水平顯著高于正常對照組;當(dāng)SWCNT暴露劑量為100μg/m L時,內(nèi)皮細胞表達磷酸化和非磷酸化p38MAPK水平與正常對照組相比,均顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,提示p38MAPK途徑和JNK途徑可能是參與調(diào)控相關(guān)凝血因子的主要通路。結(jié)論1.單壁碳納米管經(jīng)呼吸道暴露可導(dǎo)致大鼠肺臟免疫炎性反應(yīng)和病理性改變,血管內(nèi)皮損傷及機體凝血纖溶系統(tǒng)功能紊亂。2.SWCNT對體外培養(yǎng)的大鼠肺泡巨噬細胞具有毒性作用,誘導(dǎo)細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生增加及持續(xù)分泌前炎癥因子。而TNF-α可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞分泌凝血纖溶相關(guān)因子發(fā)生改變。3.相對于SWCNT直接暴露而言,通過大鼠肺泡巨噬細胞介導(dǎo)的間接暴露在誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能紊亂方面的作用可能更為顯著。p38MAPK和JNK信號通路可能參與調(diào)控此間接毒性作用。這種間接毒性作用是區(qū)別于以往研究認為的納米材料直接作用的一個重要發(fā)病機制。4.肺免疫毒性在介導(dǎo)SWCNT所致機體凝血纖溶系統(tǒng)改變中發(fā)揮重要作用,其機制之一為:SWCNT通過導(dǎo)致大鼠肺泡巨噬細胞釋放炎癥因子,從而間接介導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙,進而使機體發(fā)生凝血纖溶相關(guān)活化因子的改變而引起凝血纖溶系統(tǒng)功能紊亂。
【關(guān)鍵詞】：單壁碳納米管 血管內(nèi)皮功能紊亂 炎性因子 凝血纖溶活化因子 間接毒性
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R563
【目錄】：

• 縮略詞表6-7
• 摘要7-11
• ABSTRACT11-16
• 前言16-22
• 1 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀16-17
• 2 立題依據(jù)17-19
• 3 研究內(nèi)容與擬解決的科學(xué)問題19-20
• 3.1 研究內(nèi)容19-20
• 3.2 擬解決的科學(xué)問題20
• 4 理論意義與實用價值20-21
• 5 技術(shù)路線21-22
• 第一章 單壁碳納米管暴露整體動物實驗22-49
• 1 引言22
• 2 實驗材料22-23
• 2.1 實驗動物22
• 2.2 主要試劑22
• 2.3 主要實驗儀器與耗材22-23
• 3 實驗方法23-29
• 3.1 染毒懸液的制備與納米材料表征23-24
• 3.2 實驗動物分組及染毒方法24-25
• 3.3 炎性細胞因子的測定25
• 3.4 組織病理學(xué)檢測25
• 3.5 SWCNT暴露致大鼠血液成分及血流變學(xué)相關(guān)指標的測定25
• 3.6 大鼠血管內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)觀察25-26
• 3.7 大鼠血漿中凝血纖溶活化因子的測定26
• 3.8 免疫組化分析血管內(nèi)膜凝血纖溶相關(guān)因子的表達26-27
• 3.9 大鼠外周血中相關(guān)基因的表達27-28
• 3.10 統(tǒng)計學(xué)處理28-29
• 4 實驗結(jié)果29-37
• 4.1 炎性細胞因子的測定結(jié)果29-30
• 4.2 組織病理學(xué)檢測結(jié)果30-31
• 4.3 大鼠血液成分及血流變學(xué)相關(guān)指標測定結(jié)果31-33
• 4.4 大鼠血管內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)觀察33
• 4.5 大鼠血漿中凝血纖溶活化因子的測定33-35
• 4.6 凝血纖溶相關(guān)因子在血管內(nèi)膜的表達35-36
• 4.7 大鼠外周血中相關(guān)基因的表達36-37
• 5 小結(jié)37-38
• 6 討論38-42
• 7 附表42-49
• 第二章 單壁碳納米管對大鼠肺泡巨噬細胞的毒性效應(yīng)49-62
• 1 引言49
• 2 實驗材料49
• 2.1 肺泡巨噬細胞株49
• 2.2 主要試劑49
• 2.3 主要實驗儀器與耗材49
• 3 實驗方法49-52
• 3.1 NR8383 細胞培養(yǎng)方法49-50
• 3.2 納米顆粒懸液的配制與細胞染毒50
• 3.3 細胞形態(tài)學(xué)觀察50-51
• 3.4 細胞活性測定51
• 3.5 活性氧族的測定51
• 3.6 細胞分泌炎性因子的測定51-52
• 3.7 統(tǒng)計學(xué)處理52
• 4 實驗結(jié)果52-57
• 4.1 細胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果52-53
• 4.2 細胞活性測定結(jié)果53
• 4.3 細胞活性氧族測定結(jié)果53-55
• 4.4 細胞炎性因子分泌結(jié)果55-57
• 5 小結(jié)57
• 6 討論57-60
• 7 附表60-62
• 第三章 單壁碳納米管呼吸道暴露導(dǎo)致機體凝血纖溶系統(tǒng)改變的間接毒性作用機制 . 5762-83
• 1 引言62
• 2 實驗材料62-63
• 2.1 實驗動物62
• 2.2 主要試劑62-63
• 2.3 主要實驗儀器與耗材63
• 3 實驗方法63-68
• 3.1 RAECs原代培養(yǎng)方法63-64
• 3.2 納米顆粒懸液的配制與細胞染毒64
• 3.3 RAECs細胞活性測定64-65
• 3.4 炎性因子刺激模型的建立及RAECs分泌凝血纖溶相關(guān)活性因子的表達65
• 3.5 內(nèi)皮細胞間接暴露模型的建立65
• 3.6 間接暴露對RAECs分泌凝血纖溶相關(guān)因子的影響65-66
• 3.7 Western Blot檢測RAECs相關(guān)蛋白的表達66-67
• 3.8 統(tǒng)計學(xué)處理67-68
• 4 實驗結(jié)果68-73
• 4.1 RAECs的鑒定68
• 4.2 RAECs活性測定結(jié)果68-69
• 4.3 炎性因子誘導(dǎo)RAECs分泌凝血纖溶相關(guān)因子的表達69-71
• 4.4 間接暴露對RAECs分泌凝血纖溶相關(guān)因子的影響71-72
• 4.5 RAECs相關(guān)蛋白的表達結(jié)果72-73
• 5 小結(jié)73-74
• 6 討論74-79
• 7 附表79-83
• 結(jié)論83-84
• 參考文獻84-92
• 文獻綜述92-98
• 參考文獻94-98
• 代表性論著98-119
• 個人簡介119-121
• 致謝121

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李俊芳;閆妍;盧曉靜;楊海峰;白樺;王超;;納米粒子的生物安全性研究進展[J];材料導(dǎo)報;2011年01期

2 陳建勇;王聰;王娟;曹禮榮;;MAPK信號通路研究進展[J];中國醫(yī)藥科學(xué);2011年08期

3 黃雪蓮,金昱,郭新彪,王蕓,朱彤,胡敏;沙塵暴PM_(2.5)、PM_(10)對大鼠肺泡巨噬細胞炎性因子分泌的影響[J];環(huán)境與健康雜志;2004年01期

4 顏培華,李鳳芝;大鼠主動脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)及鑒定方法[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;1993年02期

5 黃潔華;林治卿;劉麗華;劉煥亮;胡傳祿;程文文;襲著革;;單壁碳納米管與碘化鈉形成C-I共價鍵[J];解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2011年02期

6 蔡虹;鄔繼紅;趙百孝;楊陟華;胡海;韓麗;朱茂祥;;艾煙冷凝物對大鼠肺泡巨噬細胞NR8383活性和吞噬功能的影響[J];北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報;2013年07期

7 王發(fā)選;許紅霞;張洋;楊婷;黃程君;任曉慧;蘭亞佳;張勤;;SiO_2粉塵刺激對NR8383細胞分泌炎癥因子的影響[J];川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2014年06期

8 游莉,冷平;血栓前狀態(tài)實驗室檢查的國內(nèi)研究現(xiàn)狀[J];四川省衛(wèi)生管理干部學(xué)院學(xué)報;2003年01期

9 襲著革;;納米材料對心血管系統(tǒng)影響的研究進展[J];生態(tài)毒理學(xué)報;2010年01期

10 TIAN Lei;LIN Zhi Qing;LIN Ben Cheng;LIU Huan Liang;YAN Jun;XI Zhu Ge;;Single Wall Carbon Nanotube Induced Inflammation in Cruor-Fibrinolysis System[J];Biomedical and Environmental Sciences;2013年05期

，

本文編號：602243