發(fā)布時(shí)間：2017-07-29 12:00

  本文關(guān)鍵詞：解偶聯(lián)蛋白2在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 急性肺損傷 脂多糖 炎癥損傷 解偶聯(lián)蛋白2 京尼平 MAPK信號(hào)通路 NF-κB

【摘要】：1.研究背景和目的:急性肺損傷(acute lung injury,ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是臨床常見(jiàn)的危重癥,雖然已經(jīng)對(duì)ALI/ARDS進(jìn)行了長(zhǎng)期的研究,但目前仍缺乏有效的治療手段,病死率仍高達(dá)30~40%。ALI/ARDS的發(fā)生、發(fā)展是全身失控性炎癥反應(yīng)的結(jié)果,病理特征包括中性粒細(xì)胞聚集,肺泡-毛細(xì)血管的損傷和通透性增加,肺內(nèi)大量蛋白和炎癥因子滲出。線(xiàn)粒體在肺泡上皮損傷中發(fā)揮著重要作用,參與了細(xì)胞凋亡信號(hào)通路,如調(diào)節(jié)活性氧生成、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)平衡,穩(wěn)定線(xiàn)粒體膜電位,或控制鈣穩(wěn)態(tài)。此外,研究表明,線(xiàn)粒體和炎癥反應(yīng)的相互作用在炎癥性疾病中占有重要地位,但兩者在急性肺損傷發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。解偶聯(lián)蛋白(Uncoupling proteins,UCPs)是位于線(xiàn)粒體內(nèi)膜的陰離子質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員,調(diào)控免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng),目前在人類(lèi)中共發(fā)現(xiàn)5種亞型,分別命名為UCP1~5,其中UCP2是研究得較早較多的解偶聯(lián)蛋白,目前發(fā)現(xiàn)UCP2在心臟、腦、肝臟等器官的炎癥損傷中發(fā)揮了重要作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道在系統(tǒng)性炎癥和感染的患者體內(nèi)UCP2表達(dá)增加,與患者的死亡率存在相關(guān)性。急性肺損傷是全身失控性炎癥反應(yīng)的結(jié)果,因此UCP2可能成為急性肺損傷治療的潛在靶點(diǎn)。但UCP2在急性肺損傷中的作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道,本研究探討了UCP2在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型炎癥損傷中的作用及機(jī)制。本研究構(gòu)建了過(guò)表達(dá)UCP2的腺病毒載體,體內(nèi)轉(zhuǎn)染C57BL/6小鼠,上調(diào)小鼠肺組織UCP2的表達(dá);通過(guò)京尼平下調(diào)UCP2的表達(dá)。在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型中,通過(guò)Western Blot(WB)、免疫組化檢測(cè)腺病毒在小鼠肺組織中UCP2的表達(dá)情況;觀(guān)察UCP2對(duì)肺組織病理改變和肺泡-毛細(xì)血管屏障通透性、細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡的影響;線(xiàn)粒體功能的改變;MAPK、NF-κB通路的激活情況,探討UCP2在A(yíng)LI/ARDS發(fā)生、發(fā)展中的作用,為ALI/ARDS的防治提供新的靶點(diǎn)和方向。2.研究方法:(1)ucp2過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建分離小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞提取總rna,rt-pcr擴(kuò)增小鼠ucp2cdna,將其亞克隆至病毒穿梭載體pyr-adshuttle-1進(jìn)行dna測(cè)序鑒定,并轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝,獲得重組腺病毒ucp2-ad。用經(jīng)鼻滴注建立c57bl/6j小鼠腺病毒ucp2-ad體內(nèi)感染模型,同時(shí)使用空病毒載體ucp2-nc作為陰性對(duì)照,通過(guò)免疫組化、westernblot檢測(cè)ucp2在肺組織的表達(dá)情況。(2)觀(guān)察ucp2對(duì)急性肺損傷小鼠炎癥損傷的影響腺病毒轉(zhuǎn)染后第3d腹腔注射lps(15mg/kg)建立急性肺損傷小鼠模型。lps處理前使用京尼平預(yù)處理,抑制肺組織ucp2的表達(dá)。ali后24h處死小鼠,檢測(cè)小鼠肺組織病理改變、肺水腫程度、支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子含量,探討ucp2對(duì)肺組織炎癥損傷的影響;通過(guò)westernblot檢測(cè)cleavedcaspase3表達(dá)、細(xì)胞色素c的釋放和bcl-2家族蛋白在各組小鼠肺組織的表達(dá),tunel檢測(cè)肺泡細(xì)胞凋亡情況,探討ucp2對(duì)肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響。(3)觀(guān)察ucp2對(duì)急性肺損傷后mapk和nf-κb通路的影響進(jìn)一步觀(guān)察ucp2對(duì)急性肺損傷后促分裂原活化蛋白激酶(mapk)通路的影響,通過(guò)westernblot檢測(cè)p38mapk、jun氨基末端激酶(junn-terminalkinase,jnk)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,erk)的激活情況,elisa檢測(cè)炎癥因子的水平,并分別給予p38mapk特異性抑制劑sb203580、jnk抑制劑sp600125或erk抑制劑pd98059,觀(guān)察ucp2對(duì)mapk信號(hào)通路和下游炎癥因子的影響,并明確哪一條mapk信號(hào)通路參與了ucp2調(diào)控的肺部炎癥損傷。觀(guān)察京尼平對(duì)mapk信號(hào)通路的影響,進(jìn)一步證實(shí)京尼平通過(guò)哪條信號(hào)通路保護(hù)lps誘導(dǎo)的急性肺損傷。此外,觀(guān)察ucp2和京尼平對(duì)nf-κb信號(hào)通路的影響,并通過(guò)檢測(cè)atp水平和5'-amp激活性蛋白激酶(5'-amp-activatedproteinkinase,ampk)信號(hào)通路的激活情況明確其調(diào)控機(jī)制。3.結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)ucp2的腺病毒載體ucp2-ad和對(duì)照空載病毒ucp2-nc。通過(guò)免疫組化和westernblot證實(shí)腺病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染可以顯著增加肺組織ucp2的表達(dá)(p0.05),主要表達(dá)于肺泡細(xì)胞。ucp2-ad感染滴度為5x108pfu/鼠,最佳感染時(shí)間為3d,并且通過(guò)病理學(xué)檢測(cè)證實(shí)腺病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染不會(huì)引起肺組織炎癥反應(yīng)。(2)ucp2表達(dá)于正常小鼠肺組織,lps處理后ucp2的表達(dá)顯著增加(p0.05);UCP2過(guò)表達(dá)可顯著加重LPS引起的肺組織病理改變、增加炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺組織出血,增加肺組織濕干重比(P0.05),促進(jìn)肺水腫;增加炎癥因子TNF-、IL-1β的表達(dá)(P0.05);降低急性肺損傷小鼠的存活率(P0.05)。此外,UCP2加重肺泡細(xì)胞線(xiàn)粒體功能不全,減少ATP生成,增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放,增加激活型caspase 3的表達(dá),TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加,促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P0.05)。相反,京尼平抑制UCP2的表達(dá)可以顯著減輕急性肺損傷后肺組織的炎癥損傷和細(xì)胞凋亡。(3)UCP2促進(jìn)了肺損傷后MAPK通路p38 MAPK、JNK、ERK的激活,促進(jìn)TNF-α、IL-1β的釋放。P38、JNK抑制劑能顯著抑制UCP2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥因子釋放,但ERK抑制劑沒(méi)有作用,結(jié)果提示UCP2可能是通過(guò)p38 MAPK、JNK通路,而不是通過(guò)ERK通路促進(jìn)肺組織炎癥損傷和細(xì)胞凋亡。此外,UCP2通過(guò)抑制ATP水平激活A(yù)MPK通路,進(jìn)而激活了NF-κB。UCP2抑制劑京尼平可以顯著抑制p38MAPK、JNK、NF-κB通路的激活、細(xì)胞凋亡和炎癥因子的釋放。4.結(jié)論:(1)上調(diào)UCP2的表達(dá)加重急性肺損傷炎癥損傷,下調(diào)UCP2的表達(dá)對(duì)急性肺損傷起保護(hù)作用;(2)UCP2加重ALI肺組織線(xiàn)粒體功能障礙,促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞凋亡;(3)JNK、p38 MAPK、NF-κB信號(hào)通路可能參與了UCP2對(duì)急性肺損傷的調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：急性肺損傷 脂多糖 炎癥損傷 解偶聯(lián)蛋白2 京尼平 MAPK信號(hào)通路 NF-κB
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R563.8
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 調(diào)節(jié)小鼠肺組織UCP2的表達(dá)13-36
• 2.1 材料與方法13-24
• 2.2 結(jié)果24-28
• 2.3 討論28-35
• 2.4 小結(jié)35-36
• 第三章 UCP2加重脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的炎癥損傷36-56
• 3.1 材料與方法36-42
• 3.2 結(jié)果42-50
• 3.3 討論50-54
• 3.4 小結(jié)54-56
• 第四章 UCP2對(duì)急性肺損傷后MAPK和NF-ΚB信號(hào)通路的影響56-71
• 4.1 材料與方法56-59
• 4.2 結(jié)果59-66
• 4.3 討論66-70
• 4.4 小結(jié)70-71
• 全文結(jié)論71-72
• 參考文獻(xiàn)72-86
• 文獻(xiàn)綜述一 UCP2在疾病中作用的研究進(jìn)展86-101
• 參考文獻(xiàn)92-101
• 文獻(xiàn)綜述二 線(xiàn)粒體解偶聯(lián)蛋白2在炎癥中的作用101-110
• 參考文獻(xiàn)105-110
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的文章110-111
• 致謝111

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本文編號(hào)：589008