本文關(guān)鍵詞：ROCK抑制劑法舒地爾對(duì)脂多糖致大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 法舒地爾 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞 凋亡 脂多糖 Rho激酶 活性氧 炎性因子

【摘要】：細(xì)菌性膿毒癥及其伴隨的嚴(yán)重的并發(fā)癥是臨床常見的、威脅生命的疾病。而所有這些并發(fā)癥的一個(gè)共同點(diǎn)就是內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙。肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（PMVECs）是肺組織的重要實(shí)質(zhì)細(xì)胞，在肺損傷過程中既是首位受損傷的靶細(xì)胞，又是活躍的炎癥細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，在疾病發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。因此，深入探討PMVECs損傷機(jī)制在肺循環(huán)疾病的研究中至關(guān)重要。 感染尤其是革蘭氏陰性菌膿毒癥是急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（ALI/ARDS）等肺循環(huán)疾病的主要病因。細(xì)菌脂多糖（LPS）作為革蘭陰性桿菌外膜上的一種糖蛋白，在體內(nèi)可引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，直接或間接損傷PMVECs，在感染性ALI/ARDS的病理過程中起關(guān)鍵作用。炎性刺激下PMVECs損傷的調(diào)控機(jī)制涉及復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究發(fā)現(xiàn)，在ALI/ARDS、肺動(dòng)脈高壓、肺癌等疾病的發(fā)生發(fā)展中均有RhoA/Rho激酶（ROCK）信號(hào)通路的參與。RhoA/ROCK通路作為體內(nèi)普遍存在的一條信號(hào)通路，在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著信號(hào)轉(zhuǎn)換器或分子開關(guān)的作用，能夠誘發(fā)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞周期進(jìn)程等。然而，RhoA/ROCK通路在LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs損傷中的調(diào)節(jié)機(jī)制以及與其他信號(hào)通路的交叉反應(yīng)尚需進(jìn)一步研究。因此，本實(shí)驗(yàn)以LPS誘導(dǎo)大鼠PMVECs損傷為模型，觀察RhoA/ROCK通路在PMVECs損傷中的變化。并通過細(xì)胞免疫化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦及細(xì)胞分子生物學(xué)等技術(shù)研究ROCK抑制劑法舒地爾對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs損傷的影響，深入探討其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。第一部分RhoA/ROCK通路參與LPS誘導(dǎo)的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷 目的：研究RhoA/ROCK通路在LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs損傷中的變化及可能機(jī)制。 方法：組織貼塊法原代培養(yǎng)大鼠PMVECs，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)染色及透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)鑒定大鼠PMVECs；MTT及乳酸脫氫酶（LDH）法測(cè)定PMVECs細(xì)胞活力；RT-PCR檢測(cè)RhoA、ROCK1mRNA的表達(dá)；Western blot檢測(cè)MYPT1磷酸化水平。 結(jié)果：1PMVECs體外培養(yǎng)及鑒定 采用組織貼塊法并加以改良成功培養(yǎng)出大鼠PMVECs，去除組織塊繼續(xù)培養(yǎng)3~5天后，基本形成細(xì)胞單層，匯合呈典型的鋪路鵝卵石狀排列。VIII因子相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)染色表明，約95%的細(xì)胞表現(xiàn)為陽性。電鏡結(jié)果表明：多數(shù)細(xì)胞均可觀察到質(zhì)膜突起，即微絨毛；在細(xì)胞漿中還觀察到W-P小體；另外有大量的質(zhì)膜小泡（又稱吞飲小泡）存在于細(xì)胞漿內(nèi)，上述結(jié)構(gòu)符合典型的內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特征。結(jié)合我們的取材部位為肺外邊緣組織，因此可以證實(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞的確為肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞。2LPS對(duì)大鼠PMVECs細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及法舒地爾的干預(yù)作用 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組（OD值為0.95±0.12）相比，0.01、0.1、1μg/ml LPS對(duì)大鼠PMVECs生長(zhǎng)沒有明顯影響；而10、100μg/ml LPS處理組OD值分別降為0.75±0.19（P 0.05）和0.50±0.12（P 0.01），細(xì)胞生長(zhǎng)明顯抑制。10μg/ml LPS能明顯造成PMVECs損傷，但又不至于導(dǎo)致?lián)p傷過重，仍留有足夠數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因此，初步選定用10μg/ml LPS制作PMVECs損傷模型。10μg/ml LPS作用6h和12h時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒有明顯影響，作用24h時(shí)OD值為0.73±0.19，與LPS作用0h（OD值為0.93±0.15）相比，PMVECs生長(zhǎng)明顯受到抑制（P 0.05），在48h和72h時(shí)，仍處于較低水平。25，50μM法舒地爾預(yù)處理對(duì)LPS作用24h導(dǎo)致的細(xì)胞損傷有不同程度的改善（與LPS組相比，P 0.05）。3LPS對(duì)大鼠PMVECs LDH活性的影響及法舒地爾的干預(yù)作用 對(duì)照組上清液中LDH活性為127.6±17.3U/L，0.1、1、10、100μg/mlLPS作用24h均不同程度地引起LDH的活性升高，分別升至155.1±23.4U/L（P 0.05）、162.3±34.3U/L（P 0.05）、189.1±25.1U/L（P 0.01）及194.7±22.7U/L（P 0.01）。10μg/ml LPS作用6h時(shí)LDH活性明顯升至139.7±19.2U/L，，與LPS作用0h（LDH活性114.1±21.1U/L）相比差異顯著（P 0.05），隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，LDH活性持續(xù)增高，說明PMVECs受損越來越嚴(yán)重。不同濃度（10，25，50μM）法舒地爾預(yù)處理組上清液中LDH活性均有不同程度地下降（P 0.05或P 0.01），進(jìn)一步說明法舒地爾在一定程度上減少了LDH的釋放，改善了LPS誘導(dǎo)的PMVECs損傷。4LPS誘導(dǎo)的PMVECs損傷中RhoA、ROCK1mRNA表達(dá)的變化 與對(duì)照組（LPS0min）相比，10μg/ml LPS作用15min即開始明顯誘導(dǎo)大鼠PMVECs中RhoA mRNA的表達(dá)（P 0.05），作用5min即明顯誘導(dǎo)ROCK1mRNA的表達(dá)（P 0.05）。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，RhoA、ROCK1mRNA的表達(dá)逐漸升高，RhoA mRNA的表達(dá)在LPS作用60min時(shí)達(dá)到最高（P 0.01），ROCK1mRNA的表達(dá)在LPS作用15min和60min時(shí)出現(xiàn)兩次表達(dá)高峰（P 0.01）。隨后，RhoA、ROCK1mRNA的表達(dá)雖有所下降，但直到240min仍顯著高于對(duì)照組（LPS0min）（P 0.01）。表明RhoA/ROCK信號(hào)通路可能參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs損傷。5LPS對(duì)PMVECs中MYPT1磷酸化水平的影響及法舒地爾的干預(yù)作用 ROCK活化后，進(jìn)一步磷酸化其下游底物MYPT1，因此，MYPT1磷酸化水平的高低反映了ROCK的活化程度。Western blot結(jié)果顯示，10μg/ml LPS在作用5min即明顯誘導(dǎo)了大鼠PMVECs中p-MYPT1的表達(dá)（P 0.05），且在15min時(shí)MYPT1磷酸化水平達(dá)到最高（P 0.01）。隨后，p-MYPT1的表達(dá)雖有不同程度地下降，但直到120min仍顯著高于對(duì)照組（LPS0min）（P 0.01）。法舒地爾10、25、50μM預(yù)處理不同程度地降低LPS作用15min誘導(dǎo)的p-MYPT1的表達(dá)（P 0.05或P 0.01）。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功分離和培養(yǎng)了原代大鼠PMVECs。LPS明顯誘導(dǎo)了大鼠PMVECs損傷，RhoA/ROCK信號(hào)通路參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs損傷。 第二部分法舒地爾對(duì)LPS致大鼠PMVECs凋亡、骨架重排的影響及機(jī)制研究 目的：探討ROCK抑制劑法舒地爾對(duì)LPS致大鼠PMVECs凋亡及骨架重排的影響及作用機(jī)制。 方法：AnnexinV/PI及Hoechst33258熒光染色法檢測(cè)大鼠PMVECs凋亡；F-actin免疫熒光染色觀察PMVECs骨架結(jié)構(gòu)的改變；Western blot檢測(cè)ERK1/2、JNK1/2/3、p38的磷酸化水平以及Bax、Bcl-2凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1法舒地爾對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡的影響 1.1LPS作用不同時(shí)間對(duì)大鼠PMVECs凋亡的影響 結(jié)果顯示：10μg/ml LPS作用6h對(duì)凋亡沒有明顯影響。與對(duì)照組（LPS0h，早期和晚期凋亡率分別為3.1±0.7%和1.0±0.3%）相比，LPS作用12、24、48、72h各時(shí)間點(diǎn)的早期凋亡率分別增至15.1±3.8%（P 0.01），24.3±3.6%（P 0.01），34.8±4.5%（P 0.01）和43.2±8.2%（P 0.01）。晚期凋亡率分別增至2.1±0.9%（P 0.05），9.6±2.1%（P 0.01），12.2±4.7%（P 0.01），29.1±7.4%（P 0.01），均有不同程度的增加，說明LPS明顯誘導(dǎo)了大鼠PMVECs凋亡。 1.2法舒地爾明顯降低了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡 與對(duì)照組（早期和晚期凋亡率分別為2.1±0.7%和3.0±0.7%）相比，LPS作用24h早期和晚期凋亡率分別增至37.8±8.1%（P 0.01）和10.7±2.6%（P 0.01）。10,25和50μM法舒地爾預(yù)處理明顯降低了LPS誘導(dǎo)的PMVECs凋亡，早期凋亡率分別降至27.7±4.6%（P 0.05），21.8±5.9%（P 0.01）和18.6±3.9%（P 0.01）；而晚期凋亡率分別降至7.5±1.3%（P 0.05），6.4±1.3%（P 0.05）和5.3±1.4%（P 0.01），與LPS組相比差異顯著，說明法舒地爾明顯干預(yù)了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡。 1.3法舒地爾改善了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡形態(tài)的改變 采用Hoechst33258染色觀察了PMVECs凋亡的形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果可見，正常對(duì)照組細(xì)胞核呈較規(guī)整的圓形或橢圓形，邊緣整齊，呈彌漫均勻的低強(qiáng)度藍(lán)色熒光，無明顯的調(diào)亡細(xì)胞；10μg/ml LPS處理24h后，細(xì)胞核致密濃染，核固縮，呈月牙形，并呈高亮度熒光，部分核染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化，表明LPS明顯誘導(dǎo)了PMVECs凋亡。10，25和50μM法舒地爾干預(yù)后核濃染、固縮等具有明顯凋亡形態(tài)的細(xì)胞與LPS組相比均有不同程度的減少，進(jìn)一步說明法舒地爾能明顯干預(yù)LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡。 1.4法舒地爾對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，10μg/ml LPS作用24h明顯上調(diào)了Bax的蛋白表達(dá)（P 0.01），同時(shí)也顯著降低了Bcl-2的蛋白表達(dá)（P 0.01）。而不同濃度（10，25，50μM）的法舒地爾預(yù)處理明顯逆轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)的Bax和Bcl-2的表達(dá)失衡情況，不同程度的抑制了Bax的表達(dá)，升高了Bcl-2的表達(dá)（P 0.05或P 0.01），表明法舒地爾可能通過調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡。 2法舒地爾對(duì)PMVECs骨架蛋白F-actin分布的影響 正常對(duì)照組可見少量的肌動(dòng)蛋白纖維絲，主要分布在細(xì)胞周邊，且線條完整連續(xù)。10μg/ml LPS處理后，胞漿F-actin纖維絲明顯增多，大多沿細(xì)胞呈縱軸排列。細(xì)胞周邊的F-actin逐漸斷裂消失，胞漿中出現(xiàn)密集的束狀應(yīng)力纖維。且隨著LPS作用時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)-actin在細(xì)胞內(nèi)雜亂無章、彌散分布，甚至細(xì)胞間失去正常連接結(jié)構(gòu)。而在預(yù)處理了ROCK抑制劑法舒地爾（10，25，50μM）的細(xì)胞中，LPS誘導(dǎo)的PMVECs應(yīng)力纖維形成和細(xì)胞骨架形態(tài)改變的現(xiàn)象均被不同程度地抑制，F(xiàn)-actin表達(dá)及熒光強(qiáng)度也明顯減弱，說明法舒地爾能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的PMVECs骨架結(jié)構(gòu)的改變。 3法舒地爾對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs中MAPKs活化的影響 LPS（10μg/ml）在作用15min時(shí)即開始明顯誘導(dǎo)大鼠PMVECs中ERK1/2磷酸化水平明顯升高，且在60min時(shí)ERK1/2磷酸化水平達(dá)到最高。相同實(shí)驗(yàn)條件下，預(yù)先加入不同濃度的法舒地爾預(yù)處理，并沒有改變LPS誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化水平的升高，說明在LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡中ERK1/2并不是RhoA/ROCK的下游信號(hào)。另外，從JNK1/2/3及p38MAPKs的活化程度來看，LPS（10μg/ml）在作用5min時(shí)即開始明顯誘導(dǎo)大鼠PMVECs中JNK1/2/3及p38磷酸化水平增高，且在30min時(shí)二者的磷酸化水平均達(dá)到最高。相同實(shí)驗(yàn)條件下，預(yù)先加入不同濃度（10，25，50μM）的法舒地爾預(yù)處理，均不同程度地抑制了LPS作用30min誘導(dǎo)的JNK1/2/3及p38磷酸化水平的增高（P 0.05或P 0.01）。說明JNK1/2/3及p38可能作為RhoA/ROCK的下游信號(hào)分子參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡。 4JNK和p38MAPKs的活化參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡 為進(jìn)一步闡明JNK和p38的活化參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡。我們?cè)诮酉聛淼膶?shí)驗(yàn)中觀察了SB203580（p38抑制劑）以及SP600125（JNK抑制劑）對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。SB203580（10μM）、SP600125（20μM）預(yù)處理分別明顯抑制了LPS誘導(dǎo)的p38和JNK1/2/3磷酸化水平的增高（P 0.01），說明SP600125和SB203580能分別起到抑制JNK1/2/3和p38MAPKs活化的作用。凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，SB203580和SP600125預(yù)處理明顯抑制了LPS誘導(dǎo)的PMVECs凋亡，早期和晚期凋亡率有不同程度下降（P 0.05或P 0.01）。同時(shí)，SB203580及SP600125預(yù)處理還明顯逆轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)失衡情況，抑制了Bax的表達(dá)，升高了Bcl-2的表達(dá)（P 0.01），進(jìn)一步說明JNK和p38的活化參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡。 結(jié)論：JNK1/2/3和p38MAPKs作為ROCK的下游信號(hào)分子參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡。法舒地爾作為唯一在臨床應(yīng)用的ROCK抑制劑，明顯干預(yù)了LPS誘導(dǎo)的凋亡、骨架蛋白重排等細(xì)胞損傷，這一保護(hù)作用與其抑制ROCK通路及其下游JNK1/2/3和p38MAPKs信號(hào)分子活化有關(guān)。 第三部分法舒地爾對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs炎性因子表達(dá)的影響及機(jī)制研究 目的：研究法舒地爾對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs炎性因子表達(dá)的影響，并從氧化損傷角度出發(fā)探討其作用機(jī)制。 方法：RT-PCR檢測(cè)IL-6、TNF-α及MCP-1mRNA的表達(dá)；ELISA法檢測(cè)上清液中IL-6和MCP-1的含量；激光共聚焦檢測(cè)PMVECs中ROS的產(chǎn)生；試劑盒測(cè)定PMVECs中SOD、GSH-PX活力及MDA含量；Westernblot法測(cè)定PMVECs全蛋白及核蛋白中NF-κB p65的表達(dá)。 結(jié)果： 1法舒地爾對(duì)PMVECs中IL-6、TNF-α及MCP-1mRNA表達(dá)的影響與對(duì)照組（LPS0h）相比，10μg/ml LPS在作用3h時(shí)IL-6和MCP-1mRNA的表達(dá)即開始明顯升高（P 0.01），6h時(shí)MCP-1mRNA表達(dá)水平達(dá)到最高，12h時(shí)IL-6mRNA表達(dá)水平達(dá)到最高，一直到48h，IL-6和MCP-1mRNA仍處于高表達(dá)水平（P 0.01）。10、25、50μM的法舒地爾預(yù)處理，均明顯抑制了LPS作用12h誘導(dǎo)的IL-6mRNA的表達(dá)（P 0.01），也不同程度地抑制了LPS作用6h誘導(dǎo)的MCP-1mRNA的表達(dá)（P 0.05或P0.01）。然而，LPS對(duì)TNF-α mRNA的表達(dá)沒有明顯影響。 2法舒地爾對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠PMVECs分泌IL-6及MCP-1的影響 與對(duì)照組（LPS0h, IL-6和MCP-1的分泌量分別為475±76pg/ml、1.082±0.389μg/ml）相比，LPS在作用3h時(shí)IL-6蛋白分泌量即開始明顯升高（P0.05），12h時(shí)分泌量達(dá)最高（1098±81pg/ml，P 0.01），一直到48h仍處于較高水平（P 0.01）。而MCP-1分泌量在LPS作用3、6、12h分別升至1.988±0.017μg/ml（P 0.05）、2.026±0.066μg/ml（P 0.05）、2.038±0.072μg/ml（P 0.05）。而且，LPS處理不同時(shí)間組與相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組相比，IL-6和MCP-1蛋白分泌量均明顯升高（P 0.05或P 0.01）。10、25、50μM的法舒地爾預(yù)處理，均不同程度地降低了LPS作用不同時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)的IL-6和MCP-1的蛋白分泌水平（P 0.05或P 0.01）。 3LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs中ROS的生成及法舒地爾對(duì)此的影響 與對(duì)照組（LPS0h）相比，10μg/ml的LPS作用從3h到48h，熒光強(qiáng)度均不同程度地增強(qiáng)（P 0.01），表明細(xì)胞內(nèi)活性氧生成量明顯升高，其中LPS處理6h時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)最高水平，12h時(shí)仍維持在接近于最高水平，隨后各時(shí)間點(diǎn)（LPS處理24h和48h）熒光強(qiáng)度有所減弱，但仍明顯高于對(duì)照組（P 0.01）。與LPS作用6h組相比，10，25，50μM的法舒地爾預(yù)處理組，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度均明顯降低（P 0.01），說明法舒地爾明顯抑制了LPS誘導(dǎo)的PMVECs內(nèi)ROS的生成。 4法舒地爾對(duì)PMVECs中SOD、GSH-PX活性和MDA含量的影響 與對(duì)照組（LPS0h）相比，10μg/ml LPS作用3、6、12、24、48h各時(shí)間點(diǎn)組，SOD活性均表現(xiàn)出不同程度的下降（P 0.05或P 0.01），其中，LPS作用12h組SOD活性降至最低。而GSH-PX活性在LPS作用6h時(shí)即開始有所下降（P 0.05），LPS作用12、24和48h時(shí)GSH-PX活性均處于較低水平（P 0.01）。相反，MDA的含量隨著LPS作用時(shí)間的延長(zhǎng)明顯升高，在LPS作用6h時(shí)即開始明顯升高（P 0.01），12h時(shí)達(dá)最高值，一直到48h，仍處于較高水平。而10，25，50μM法舒地爾預(yù)處理均不同程度地逆轉(zhuǎn)了LPS作用12h誘導(dǎo)的PMVECs中SOD和GSH-PX活性的降低（P 0.05或P0.01）；同時(shí)也不同程度地降低了MDA的含量（P 0.05或P 0.01）。 5法舒地爾對(duì)LPS作用下大鼠PMVECs中NF-κB p65核轉(zhuǎn)位的影響 與對(duì)照組（LPS0h）相比，在LPS作用不同時(shí)間點(diǎn)，全蛋白中NF-κB p65的蛋白表達(dá)沒有明顯變化。而PMVECs細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平在LPS作用3h即明顯升高（P 0.01），12h時(shí)表達(dá)水平最高，直到48h仍有較高的表達(dá)水平（P 0.01）。10，25，50μM法舒地爾預(yù)處理均明顯降低了細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65的蛋白表達(dá)（P 0.01），推測(cè)法舒地爾可能通過抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位從而降低了LPS誘導(dǎo)的炎性因子的表達(dá)。6N-acetylcysteine對(duì)LPS作用下大鼠PMVECs中IL-6、MCP-1mRNA表達(dá)及NF-kB p65核轉(zhuǎn)位的影響 5、10mM N-acetylcysteine均不同程度地降低了LPS作用12h誘導(dǎo)的細(xì)胞核內(nèi)NF-kB p65的蛋白表達(dá)（P 0.05或P 0.01），對(duì)LPS誘導(dǎo)的NF-kBp65核轉(zhuǎn)位有一定的抑制作用。同時(shí)，5、10mM N-acetylcysteine還明顯降低了LPS誘導(dǎo)的IL-6和MCP-1mRNA的表達(dá)（P 0.05或P 0.01）。 結(jié)論：（1）LPS作用下大鼠PMVECs中ROS的生成增多，炎性因子IL-6和MCP-1的表達(dá)升高。ROS抑制劑N-acetylcysteine明顯抑制了LPS誘導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)位以及炎性因子的表達(dá)，表明ROS信號(hào)參與了LPS誘導(dǎo)的PMVECs炎性損傷。（2）法舒地爾抑制了LPS誘導(dǎo)的ROS的生成，逆轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)的MDA水平的升高以及SOD和GSH-PX活性的下降，還降低了NF-κB核轉(zhuǎn)位以及炎性因子IL-6和MCP-1的表達(dá)，說明法舒地爾通過其抗氧化作用干預(yù)了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs炎性損傷。
【關(guān)鍵詞】：法舒地爾 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞 凋亡 脂多糖 Rho激酶 活性氧 炎性因子
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R563
【目錄】：

• 摘要5-13
• ABSTRACT13-23
• 英文縮寫23-24
• 引言24-25
• 第一部分 RhoA/ROCK通路參與LPS誘導(dǎo)的原代大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷25-56
• 前言25-26
• 材料與方法26-38
• 結(jié)果38-42
• 附圖42-49
• 討論49-52
• 小結(jié)52-53
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 第二部分 法舒地爾對(duì) LPS 致大鼠 PMVECs 凋亡、骨架重排的影響及機(jī)制研究56-82
• 前言56-57
• 材料與方法57-61
• 結(jié)果61-65
• 附圖65-75
• 討論75-78
• 小結(jié)78-79
• 參考文獻(xiàn)79-82
• 第三部分 法舒地爾對(duì) LPS 誘導(dǎo)的大鼠 PMVECs 炎性因子表達(dá)的影響及機(jī)制研究82-112
• 前言82-83
• 材料與方法83-89
• 結(jié)果89-93
• 附圖93-106
• 討論106-108
• 小結(jié)108-109
• 參考文獻(xiàn)109-112
• 結(jié)論112-113
• 綜述 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與肺動(dòng)脈高壓113-132
• 參考文獻(xiàn)126-132
• 致謝132-133
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷133-134

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 孔晉星;;糖尿病腎病血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及凝血纖溶功能變化實(shí)驗(yàn)研究[J];昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2007年S1期

2 柏樺;海春旭;張曉迪;劉瑞;李媛;;組織塊法培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法研究[J];科學(xué)技術(shù)與工程;2008年05期

3 賈曉民;趙杰;王海清;;堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)肺癌A459細(xì)胞pim-3表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2009年06期

本文編號(hào)：587720