導(dǎo)致嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Severe acute respiratory syndrome,SARS)的新型冠狀病毒SARS-CoV可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。SARS-CoV Spike蛋白在介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用,對冠狀病毒的包膜形成及對病毒的出芽和胞外分泌也是必要的。研究發(fā)現(xiàn),作為SARS-CoV表面最重要的膜蛋白,SARS-CoV Spike蛋白可以誘導(dǎo)VeroE6細(xì)胞凋亡。目前,對SARS-CoV Spike蛋白誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究甚少。MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與病毒誘導(dǎo)凋亡的關(guān)系是近年來研究的熱點(diǎn)之一。其中ERK1/2不僅與細(xì)胞增殖和分化密切相關(guān)而且參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。ERK1/2磷酸化下調(diào)導(dǎo)致了細(xì)胞生存信號(hào)的下降,進(jìn)而導(dǎo)致了凋亡的發(fā)生。作為重要的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白激酶途徑,ERK1/2信號(hào)途徑受到抑制是多種細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要原因。ERK1/2, p38MAPK和JNK的動(dòng)態(tài)平衡決定了細(xì)胞的存活或凋亡。 本研究證明,SARS-CoV Spike蛋白及其主要片段S318-510可以誘導(dǎo)VeroE6細(xì)胞凋亡。二者在早期可以通過抑制ERK1/2信號(hào)通路誘導(dǎo)VeroE6細(xì)胞的凋亡,...

【文章頁數(shù)】：134 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文略語表
前言
實(shí)驗(yàn)材料和方法
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 質(zhì)粒
        1.2 菌株
        1.3 工具酶、酶切緩沖液及DNA Marker
        1.4 主要化學(xué)試劑
        1.5 細(xì)胞培養(yǎng)用耗材
        1.6 試劑盒
        1.7 主要儀器及設(shè)備
        1.8 主要溶液配方
            1.8.1 E.coli用培養(yǎng)基的配制
            1.8.2 制備感受態(tài)細(xì)胞相關(guān)溶液
            1.8.3 抗生素的配制
            1.8.4 大量提取質(zhì)粒DNA的相關(guān)溶液
            1.8.5 DNA瓊脂糖凝膠電泳緩沖液及凝膠的配制
            1.8.6 細(xì)胞凍存液的配制
            1.8.7 細(xì)胞裂解液的配制
            1.8.8 蛋白質(zhì)電泳及檢測緩沖液
            1.8.9 聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的配制
            1.8.10 常用緩沖液的配制
        1.9 PCR引物
        1.10 抗體
        1.11 有關(guān)RNA提取以及Northern blotting溶液的配制
        1.12 慢病毒小量包裝
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 單鏈復(fù)性
        2.2 PCR擴(kuò)增
        2.3 酶切消化
        2.4 連接
        2.5 轉(zhuǎn)化
        2.6 鑒定
        2.7 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.8 質(zhì)粒DNA的小提
        2.9 質(zhì)粒DNA的大量提取
        2.10 重組質(zhì)粒DNA濃度的測定
        2.11 DNA的純化回收
        2.12 貼壁細(xì)胞培養(yǎng)
        2.13 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建
        2.14 細(xì)胞凍存
        2.15 細(xì)胞復(fù)蘇
        2.16 細(xì)胞裂解
        2.17 DNA ladder分析
        2.18 Annexin-V/PI雙染流式分析測定早期細(xì)胞凋亡
        2.19 總RNA的提取及定量
            2.19.1 組織勻漿
            2.19.2 總RNA的抽提
            2.19.3 總RNA的沉淀
            2.19.4 總RNA的洗滌和溶解
            2.19.5 總RNA的檢測
        2.20 Northern blotting實(shí)驗(yàn)
            2.20.1 探針的制備與純化
            2.20.2 甲醛變性電泳凝膠制備
            2.20.3 樣品處理
            2.20.4 轉(zhuǎn)膜
            2.20.5 預(yù)雜交
            2.20.6 雜交
            2.20.7 洗膜
            2.20.8 信號(hào)檢測
            2.20.9 探針去除及雜交參照基因Actin
        2.21 慢病毒包裝實(shí)驗(yàn)
        2.22 病毒的收獲及濃縮
        2.23 RNA干擾有效靶點(diǎn)篩選實(shí)驗(yàn)—RT-PCR篩靶
        2.24 Annexin V/PI雙染
        2.25 Western Blotting的檢測方法
        2.26 蛋白提純
結(jié)果
    3.1 優(yōu)化S蛋白,并合成S蛋白基因
    3.2 將CD5L插入載體,構(gòu)建PEAK13 CD5L Fc質(zhì)粒
    3.3 構(gòu)建S及其片段基因的克隆,并檢測
    3.4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染P13 CD5L S1190 Fc,檢測在VeroE6細(xì)胞中的蛋白表達(dá)
    3.5 SARS-CoV Spike蛋白引起細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變
    3.6 FACS檢測早期凋亡的細(xì)胞
    3.7 轉(zhuǎn)染P13 CD5L S1190 Fc質(zhì)粒誘導(dǎo)VeroE6細(xì)胞凋亡的DNA Ladder
    3.8 加入純化的SARS-CoV 1190 Fc蛋白誘導(dǎo)VeroE6細(xì)胞凋亡
    3.9 轉(zhuǎn)染P13 CD5L S1190 Fc質(zhì)粒誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞的PARP剪切實(shí)驗(yàn)
    3.10 SARS-CoV Spike蛋白的各個(gè)片段誘導(dǎo)凋亡的情況
        3.10.1 轉(zhuǎn)染SARS-CoV S各不同片段質(zhì)粒剪切PARP實(shí)驗(yàn)
        3.10.2 SARS-CoV S317 Fc不能誘導(dǎo)凋亡
        3.10.3 SARS-CoV S318-510蛋白可以誘導(dǎo)凋亡
            3.10.3.1 轉(zhuǎn)染P13 CD5L S318-510 Fc質(zhì)粒誘導(dǎo)的DNA Ladder
            3.10.3.2 加入SARS-CoV S318-510 Fc蛋白誘導(dǎo)的DNA Ladder
            3.10.3.3 FACS
        3.10.4 轉(zhuǎn)染P13 CD5L S681-1190 Fc質(zhì)粒可以誘導(dǎo)VeroE6細(xì)胞凋亡
    3.11 SARS-CoV Spike蛋白凋亡早期下調(diào)Bcl-2,上調(diào)Bax
    3.12 SARS-CoV Spike蛋白早期抑制ERK1/2信號(hào)通路
        3.12.1 轉(zhuǎn)染P13 CD5L S1190 Fc質(zhì)粒早期抑制ERK1/2信號(hào)通路
        3.12.2 加入純化的SARS-CoV S1190 Fc蛋白誘導(dǎo)VeroE6細(xì)胞ERK1/2磷酸化信號(hào)的下調(diào)
    3.13 轉(zhuǎn)染P13 CD5L S1190 Fc早期沒有引起p38MAPK和JNK信號(hào)磷酸化水平的改變
    3.14 轉(zhuǎn)染P13 CD5L S1190 Fc質(zhì)粒早期引起凋亡相關(guān)的下游重要信號(hào)分子磷酸化的改變
    3.15 SARS-CoV S318-510蛋白也可以通過抑制ERK1/2信號(hào)通路誘導(dǎo)凋亡
    3.16 STAT3上游信號(hào)JAK1,JAK2,Tyk2磷酸化水平?jīng)]有改變
    3.17 SARS-CoV Spike蛋白和SARS-CoV S318-510蛋白早期沒有引起AKT信號(hào)改變
    3.18 SARS-CoV spike蛋白可以在蛋自及mRNA水平下調(diào)ACE2的表達(dá)
        3.18.1 SARS-CoV S1190 Fc蛋白引起受體ACE2下調(diào)實(shí)驗(yàn)
        3.18.2 Northern blotting檢測野生型C57小鼠肺臟和腎臟中ACE2的表達(dá)
            3.18.2.1 小鼠肺臟和腎臟總RNA質(zhì)量的檢測
            3.18.2.2 檢測小鼠肺臟和腎臟ACE2 mRNA表達(dá)水平
            3.18.2.3 SARS-CoV Spike蛋白下調(diào)VeroE6細(xì)胞ACE2 mRNA表達(dá)水平
    3.19 構(gòu)建慢病毒感染的ACE2敲除的VeroE6永久細(xì)胞株(ACE2 RNAi VeroE6)
        3.19.1 目的基因RNA干擾慢病毒載體制備
        3.19.2 目的基因RNA干擾陽性克隆質(zhì)粒抽提瓊脂糖凝膠電泳圖譜
        3.19.3 RT-PCR檢測目的基因的mRNA表達(dá)水平
        3.19.4 構(gòu)建慢病毒感染的ACE2 RNAi和NC RNAi的VeroE6永久細(xì)胞株
    3.20 檢測SARS-CoV Spike蛋白在ACE2 RNAi VeroE6和Nc RNAi VeroE6細(xì)胞凋亡中的作用
        3.20.1 流式細(xì)胞儀PI單染法
        3.20.2 DNA ladder法檢測細(xì)胞凋亡
討論
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
論文綜述
    參考文獻(xiàn)
附錄
致謝



本文編號(hào)：3978237