本文關(guān)鍵詞：增強(qiáng)Foxp3基因表達(dá)對(duì)支氣管哮喘發(fā)病的干預(yù)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：支氣管哮喘(哮喘)是嚴(yán)重威脅人類健康的一種疾病,全世界有大約3億哮喘患者,每年有25000人死于哮喘。哮喘是由T淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞參與的氣道慢性炎癥性疾病,氣道慢性炎癥導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性(hyperresponsiveness, AHR)的形成和氣道重構(gòu)。哮喘引起的社會(huì)和家庭問題日益成為人類社會(huì)的沉重負(fù)擔(dān)。 至今已發(fā)現(xiàn)有多種輔助性T細(xì)胞(helper T cell, Th cell),包括Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞等等。在哮喘的發(fā)病機(jī)制中,針對(duì)環(huán)境中過敏原而產(chǎn)生的Th2型細(xì)胞因子起了重要的作用。研究表明Th1/Th2細(xì)胞平衡失調(diào)即Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化過度,在過敏性疾病的發(fā)生中起重要作用。Th2細(xì)胞通過分泌IL-4、IL-5、 IL-9、IL-13等多種細(xì)胞因子來發(fā)揮促炎作用。在哮喘患者中,Th2細(xì)胞被激活,分泌一系列Th2型細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)IgE的產(chǎn)生、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、氣道粘膜高分泌及氣道結(jié)構(gòu)的改變。另一方面,機(jī)體對(duì)過敏原免疫耐受缺陷亦是導(dǎo)致哮喘發(fā)生的主要原因之一,健康者對(duì)過敏原的反應(yīng)表現(xiàn)為免疫耐受從而避免Th2型反應(yīng),而哮喘患者的耐受途徑存在異常從而不能對(duì)過敏原發(fā)生免疫耐受,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Th2型免疫反應(yīng)。 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Tregs),尤其是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Tregs),在維持機(jī)體對(duì)過敏原的免疫耐受中起主要作用。CD4+CD25+Tregs約占正常人和小鼠的外周血及脾臟組織CD4+T細(xì)胞的5%～10%. CD4+CD25+Tregs可分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β來發(fā)揮免疫抑制作用,能夠抑制Th2細(xì)胞分化、增殖及細(xì)胞因子的產(chǎn)生,對(duì)于Th2介導(dǎo)的疾病(如哮喘)是一種新的、有希望的治療途徑。Foxp3(forkhead/winged helix transcription factor)稱叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子,在CD4+CD25+Tregs特異性表達(dá),且在幼稚前體T細(xì)胞向Tregs表型分化中起著重要的作用。 迄今為止,人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)諸多因子能招募CD4+CD25+Tregs或誘導(dǎo)Foxp3在CD4+CD25-T細(xì)胞中表達(dá),從而降低Th2細(xì)胞免疫反應(yīng),抑制哮喘的病理過程和癥狀表現(xiàn)。但是這些研究都是利用全身性的方法,由于對(duì)體內(nèi)其他器官會(huì)有副作用,難免會(huì)產(chǎn)生潛在性的問題。所以我們希望在肺組織局部增強(qiáng)Foxp3基因的表達(dá),來觀察其對(duì)哮喘的發(fā)生是否有保護(hù)作用。在本研究中,我們成功構(gòu)建了攜帶有小鼠Foxp3基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體——Foxp3/PMX,然后通過氣道滴注至OVA誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠體內(nèi),觀察小鼠肺組織炎癥、氣道高反應(yīng)性、肺組織中Th2及Tregs百分比、BALF中炎癥因子含量等的變化,同時(shí)檢測(cè)抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-(3的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)肺部Foxp3基因的表達(dá)對(duì)哮喘的發(fā)病有保護(hù)作用,本研究為哮喘的免疫治療提供了新的方向。 目的：通過經(jīng)氣道滴注攜帶有小鼠Foxp3基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒,觀察增強(qiáng)肺部Foxp3基因表達(dá)對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的影響,對(duì)肺組織中Th2及Tregs細(xì)胞百分比的影響。 方法：實(shí)驗(yàn)采用BALB/c小鼠,分生理鹽水陰性對(duì)照組(Saline組)、哮喘組(OVA組)、Foxp3/PMX治療組(Foxp3組)及Empty/PMX治療組(Control組)四組,其中Foxp3/PMX治療組和Empty/PMX治療組分別經(jīng)氣道滴注Foxp3/PMX和Empty/PMX逆轉(zhuǎn)錄病毒,50μl/次,共3次。最后一次抗原激發(fā)后24小時(shí)檢測(cè)小鼠氣道反應(yīng)性,Q-PCR和Westernblot分別檢測(cè)肺組織Foxp3基因和蛋白表達(dá)水平,肺組織病理切片分別行HE和PAS染色檢測(cè)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和氣道粘液分泌情況,收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)行總細(xì)胞計(jì)數(shù)及炎癥細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺組織單核細(xì)胞中CD4+oxp3+細(xì)胞及CD4+IL-4+細(xì)胞占總的CD4+T細(xì)胞百分比。ELISA法檢測(cè)BALF中細(xì)胞因子IL-4、IL-13、IL-17、IL-10及TGF-β水平,Q-PCR檢測(cè)肺組織IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A、 IL-10及TGF-β mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果：①OVA組小鼠肺組織中Foxp3mRNA及蛋白水平均較Saline組小鼠明顯升高,OVA組小鼠肺組織淋巴細(xì)胞中CD4+Foxp3+細(xì)胞、CD4+IL-4+細(xì)胞均較Saline組小鼠明顯增加。經(jīng)氣道滴注Foxp3/PMX逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)一步增加肺組織中Foxp3mRNA及蛋白水平,同時(shí)伴隨著CD4+Foxp3+細(xì)胞百分比的增加及CD4+IL-4+細(xì)胞百分比的減少。②OVA組小鼠氣道反應(yīng)性,BALF中細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù),肺組織炎癥以及黏液分泌均較Saline組明顯增加。與Control組相比,經(jīng)氣道滴注Foxp3/PMX逆轉(zhuǎn)錄病毒顯著降低了哮喘小鼠氣道反應(yīng)性、BALF中的細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目,抑制了肺組織的氣道炎癥以及黏液分泌。③經(jīng)氣道滴注Foxp3/PMX逆轉(zhuǎn)錄病毒降低了肺組織中Th2細(xì)胞及Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)相關(guān)的IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A mRNA表達(dá)水平,降低了BALF中IL-4、IL-13、L-17細(xì)胞因子含量。④經(jīng)氣道滴注Foxp3/PMX逆轉(zhuǎn)錄病毒增加了肺組織中抑制性細(xì)胞因子IL-10及TGF-β mRNA表達(dá)水平,及肺泡灌洗液中IL-10及TGF-β1細(xì)胞因子含量。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)通過Foxp3/pMX逆轉(zhuǎn)錄病毒氣道滴注至哮喘小鼠體內(nèi),證明增強(qiáng)肺組織局部Foxp3基因的表達(dá),可增加肺部CD4+Foxp3+細(xì)胞百分比及降低CD4+IL-4+細(xì)胞百分比,顯著降低哮喘小鼠的氣道炎癥、氣道反應(yīng)性、氣道粘液分泌,改善哮喘小鼠肺部TH2、TH17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),同時(shí)伴隨著肺部抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β水平的增加。
【關(guān)鍵詞】：Foxp3 哮喘 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 Th2細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R562.25
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 縮略語中英文對(duì)照12-14
• 目錄14-15
• 前言15-18
• 材料與方法18-39
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-52
• 討論52-55
• 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 綜述61-70
• 參考文獻(xiàn)67-70
• 作者簡(jiǎn)歷70

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1 謝肖立;SM22α調(diào)節(jié)AngⅡ誘導(dǎo)的血管生理及病理學(xué)效應(yīng)的機(jī)制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：增強(qiáng)Foxp3基因表達(dá)對(duì)支氣管哮喘發(fā)病的干預(yù)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：381573