自從2002年11月在中國廣東省爆發(fā)嚴重急性呼吸綜合癥(SARS)以來,人們對SARS的病原體,一種新型的冠狀病毒,SARS冠狀病毒(SARS-CoV)進行了詳細的研究[1]。SARS-CoV表面最重要的膜蛋白一刺突蛋白(Spike protein)負責與受體結合并進入細胞[1-4]。實驗證明ACE2是SARS-CoV的一種重要的受體,主要分布于Ⅰ型和Ⅱ型腫泡上皮細胞,小腸上皮細胞以及腎臟近曲小管的刷狀緣上[5]。但是,人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)除了ACE2作為主要受體之外,SARS-CoV感染宿主細胞很可能還需要其他輔助分子的協(xié)助或者還有其他受體介導SARS-CoV進入細胞[2,5]。 在被SARS-CoV感染的病人的外周血單核細胞(PBMC)中,乳鐵蛋白的表達水平會急劇上調(diào)[7]。乳鐵蛋白具有多種生物學功能,能夠抑制細菌,病毒,真菌等微生物的感染,是在機體內(nèi)參加先天免疫反應的一種重要蛋白[8-11]。本實驗發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白能夠抑制SARS假病毒(Pseudovirus)感染293E-ACE2-Myc細胞,這種抑制效應是劑量依賴的。在體外乳鐵蛋白并不干擾Spike蛋白和ACE2受體的結合,而是通過結合...

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
目錄
中文摘要
Abstract
英文略語表
前言
1 實驗材料
    1.1 質粒
    1.2 菌株
    1.3 細胞株
    1.4 主要儀器設備
    1.5 工具酶、酶切緩沖液及DNA Marker
    1.6 主要化學試劑
    1.7 細胞培養(yǎng)用耗材
    1.8 試劑盒
    1.9 主要溶液配方
        1.9.1 培養(yǎng)基的配制
        1.9.2 制備感受態(tài)細胞相關溶液
        1.9.3 抗生素的配制
        1.9.4 大量提取質粒DNA的相關溶液
        1.9.5 DNA瓊脂糖凝膠電泳緩沖液及凝膠的配制
        1.9.6 細胞凍存液的配制
        1.9.7 細胞裂解液的配制
        1.9.8 SDS-PAGE蛋白質電泳及相關緩沖液的配制
        1.9.9 蛋白純化相關緩沖液配制
        1.9.10 常用緩沖液的配制
        1.9.11 細胞免疫熒光實驗緩沖液的配制
    1.10 PCR引物
    1.11 主要抗體
2 實驗方法
    2.1 乳鐵蛋白(lactoferrin)的PCR引物設計
    2.2 PCR擴增
    2.3 酶切消化
    2.4 連接
    2.5 轉化
    2.6 鑒定
    2.7 感受態(tài)細胞的制備
    2.8 質粒DNA的小提
    2.9 質粒DNA的大量提取
    2.10 重組質粒DNA濃度的測定
    2.11 DNA的線性化及純化回收
    2.12 貼壁細胞培養(yǎng)
    2.13 穩(wěn)定表達細胞株的構建
    2.14 細胞凍存
    2.15 細胞復蘇
    2.16 細胞裂解
    2.17 Western Blotting檢測方法
    2.18 SARS-CoV刺突蛋白S1190-Fc及對照Fc蛋白的制備
    2.19 假病毒的包裝
    2.20 假病毒滴度測定
    2.21 熒光顯微鏡觀察乳鐵蛋白抑制SARS假病毒感染293E-ACE2-Myc細胞
    2.22 Western blot分析乳鐵蛋白抑制SARS假病毒感染293E-ACE2-Myc細胞情況
    2.23 流式細胞術檢測乳鐵蛋白抑制SARS假病毒感染293E-ACE2-Myc細胞情況
    2.24 乳鐵蛋白抑制SARS-CoV刺突蛋白S1190-Fc結合293E-ACE2-Myc細胞檢測
    2.25 ELISA檢測乳鐵蛋白對S1190-Fc和293E-ACE2-Myc結合的影響
    2.26 乳鐵蛋白熒光標記
    2.27 Confocal檢測乳鐵蛋白在293E-ACE2-Myc細胞上的定位
    2.28 肝素對乳鐵蛋白結合293E-ACE2-Myc細胞的影響
    2.29 肝素對乳鐵蛋白抑制S1190-Fc結合293E-ACE2-Myc細胞的中和作用
    2.30 肝素對乳鐵蛋白抑制SARS假病毒進入293E-ACE2-Myc細胞的中和作用
    2.31 肝素對Spike蛋白結合到293E-ACE2-Myc細胞上的抑制作用
    2.32 肝素對SARS假病毒感染293E-ACE2-Myc細胞的抑制作用
    2.33 肝素酶消化細胞表面的硫酸乙酰肝素對Spike蛋白結合到293E-ACE2-Myc細胞上的抑制作用
    2.34 肝素酶消化細胞表面的硫酸乙酰肝素對SARS假病毒感染293E-ACE2-Myc細胞的抑制作用
3 實驗結果
    3.1 構建pEAK13CD5L-LF-TEVFc和pEAK13CD5L-LF質粒
    3.2 瞬時轉染細胞,Western Blot檢測乳鐵蛋白的表達
    3.3 SARS假病毒的包裝
    3.4 SARS假病毒的滴度測定
    3.5 S1190-Fc及Fc蛋白的表達純化
    3.6 乳鐵蛋白能夠抑制SARS假病毒進入293E-ACE2-Myc細胞
    3.7 乳鐵蛋白能夠抑制SARS-CoV的Spike蛋白結合到宿主細胞上
    3.8 乳鐵蛋白不干擾Spike蛋白和ACE2的相互作用
    3.9 乳鐵蛋白結合于細胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)
    3.10 肝素可以中和乳鐵蛋白對Spike蛋白的抑制作用
    3.11 肝素可以部分中和乳鐵蛋白對SARS假病毒進入293E-ACE2-Myc細胞的抑制作用
    3.12 肝素可以抑制Spike蛋白結合到293E-ACE2-Myc細胞上
    3.13 肝素可以抑制SARS假病毒感染293E-ACE2-Myc細胞
    3.14 肝素酶消化細胞表面的硫酸乙酰肝素可以抑制Spike蛋白結合到293E-ACE2-Myc細胞上
    3.15 肝素酶消化細胞表面的硫酸乙酰肝素可以抑制SARS假病毒感染293E-ACE2-Myc細胞
4 討論
5 參考文獻
綜述1
    參考文獻
綜述2
    參考文獻
致謝
個人簡歷



本文編號：3736041