發(fā)布時(shí)間：2022-08-11 11:55

　　目的:通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和整體動(dòng)物模型,體、內(nèi)外研究異硫氰酸烯丙酯（AITC）對(duì)慢性阻塞性肺疾病（COPD）肺支氣管上皮MRP1和Nrf2表達(dá)的影響。方法:體外:首先,自制香煙煙霧提取物（CSE）,采用MTT法觀察其對(duì)16HBE細(xì)胞的毒性,篩選CSE對(duì)16HBE細(xì)胞活力無(wú)明顯影響的濃度;其次,觀察CSE刺激16HBE細(xì)胞后,以Real time RT-PCR和Western Blotting法檢測(cè)Nrf2和MRP1的m RNA和蛋白表達(dá);再次,仍采用Real time RT-PCR和Western Blotting法測(cè)定,在AITC干預(yù)作用下,CSE誘導(dǎo)的16HBE的Nrf2和MRP1的m RNA和蛋白表達(dá)。體內(nèi):首先采用煙熏復(fù)合氣管滴入脂多糖的方法制備大鼠COPD模型;然后觀察AITC對(duì)COPD大鼠呼吸功能及肺組織病理學(xué)改變的影響,并采用Real time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肺組織中MRP1,Nrf2基因的表達(dá)。結(jié)果:1.連續(xù)7天自制的香煙煙霧提取物經(jīng)分析表明其穩(wěn)定性好。2.MTT結(jié)果顯示香煙煙霧提取物對(duì)16HBE細(xì)胞的抑制率具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性。10%及以下濃度對(duì)16HBE細(xì)... 

【文章頁(yè)數(shù)】：84 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
英文縮略詞
前言
    1. COPD
    2. 香煙煙霧與COPD
    3. MRP1
    4. AITC
    5. Nrf2
第一部分 AITC體外上調(diào)CSE誘導(dǎo)的MRP1和Nrf2基因和蛋白表達(dá)
    1 材料與儀器
        1.1 細(xì)胞株
        1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.3 實(shí)驗(yàn)試劑的配制
        1.4 實(shí)驗(yàn)儀器
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 香煙煙霧提取物的制備
        2.2 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)
            2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇
            2.2.2 細(xì)胞傳代
            2.2.3 細(xì)胞凍存
        2.3 MTT法檢測(cè)香煙煙霧提取物對(duì) 16HBE細(xì)胞的毒性
        2.4 香煙煙霧提取物刺激 16HBE細(xì)胞后MRP1和Nrf2的基因和蛋白表達(dá)
            2.4.1 CSE干預(yù)細(xì)胞
            2.4.2 Real time RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞m RNA
                2.4.2.1 細(xì)胞總RNA的提取
                2.4.2.2 RNA定量及純度鑒定
                2.4.2.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄為c DNA
                2.4.2.4 Real time RT-PCR擴(kuò)增目的基因
                2.4.2.5 Real time RT-PCR分析方法
            2.4.3 Western blotting檢測(cè) 16HBE細(xì)胞蛋白表達(dá)
                2.4.3.1 16HBE細(xì)胞總蛋白的提取
                2.4.3.2 BCA總蛋白定量法
                2.4.3.3 Western blotting操作步驟
        2.5 AITC預(yù)處理細(xì)胞后，CSE刺激 16HBE的MRP1和Nrf2基因和蛋白表達(dá)
        2.6 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)
    3.結(jié)果
        3.1 CSE的制備和OD值測(cè)定
        3.2 CSE對(duì) 16HBE細(xì)胞毒性的測(cè)定
        3.3 CSE干預(yù) 16HBE不同時(shí)間點(diǎn)MRP1和Nrf2的基因和蛋白表達(dá)
            3.3.1 CSE干預(yù) 16HBE不同時(shí)間點(diǎn)MRP1和Nrf2m RNA的表達(dá)
            3.3.2 CSE干預(yù) 16HBE不同時(shí)間點(diǎn)MRP1和Nrf2蛋白的表達(dá)
        3.4 AITC預(yù)處理后,CSE誘導(dǎo) 16HBE細(xì)胞MRP1和Nrf2的表達(dá)32
            3.4.1 AITC預(yù)處理后，CSE誘導(dǎo) 16HBE細(xì)胞MRP1和Nrf2的m RNA表達(dá)
            3.4.2 AITC預(yù)處理后，CSE誘導(dǎo) 16HBE細(xì)胞MRP1和Nrf2的蛋白表達(dá)
    4.討論
第二部分 AITC對(duì)COPD大鼠肺支氣管上皮中Nrf2、MRP1表達(dá)的影響
    1 材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    2 方法
        2.1 COPD大鼠模型的建立
        2.2 分組及給藥
    3 指標(biāo)的測(cè)定
        3.1 呼吸功能測(cè)定
        3.2 病理學(xué)檢查
            3.2.1 肺組織取材及石蠟切片的制作
            3.2.2 肺組織標(biāo)本切片HE染色
        3.3 Real time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肺組織標(biāo)本中MRP1、Nrf2基因表達(dá)
            3.3.1 肺組織總RNA的提取
            3.3.2 RNA定量及純度鑒定
            3.3.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄為c DNA
            3.3.4 Real time RT-PCR擴(kuò)增目的基因
            3.3.5 Real time RT-PCR分析方法
    4 結(jié)果
        4.1 大鼠一般情況
        4.2 大鼠肺功能變化
        4.3 光鏡下觀察HE染色后各組肺組織的病理學(xué)改變
        4.4 Real time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肺組織標(biāo)本中MRP1、Nrf2基因表達(dá)
    5.討論
總結(jié)
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡(jiǎn)介
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]化痰降氣膠囊對(duì)COPD模型大鼠支氣管上皮細(xì)胞中多藥耐藥相關(guān)蛋白1功能和表達(dá)的影響[J]. 汪電雷,張弦,陶秀華,張瑞,蔡莉,彭波,李澤庚.  中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志. 2012(07)
[2]HE染色原理和試劑配制及染色過(guò)程中的若干問(wèn)題的探討[J]. 李紅芬,鄭肇巽,馬品耀,平國(guó)強(qiáng).  醫(yī)學(xué)信息(上旬刊). 2011(04)
[3]脂多糖結(jié)合熏煙法和單純熏煙法建立慢性阻塞性肺病大鼠模型的比較[J]. 宋小蓮,王昌惠,白沖.  第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2010(03)
[4]慢性阻塞性肺疾病動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J]. 周紅艷,李建生.  中醫(yī)研究. 2009(05)
[5]N-乙酰半胱氨酸對(duì)煙霧暴露所致大鼠慢性阻塞性肺疾病模型的影響[J]. 蔡珊,陳平,張程,陳劍波,吳杰,羅曼.  中華結(jié)核和呼吸雜志. 2008 (08)

博士論文
[1]轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在香煙煙霧誘導(dǎo)粘蛋白MUC5AC表達(dá)中的作用[D]. 應(yīng)英華.浙江大學(xué) 2012

碩士論文
[1]慢性阻塞性肺疾病患者肺組織中Nrf2、Bach1、γ-GCS表達(dá)的研究[D]. 馮青青.鄭州大學(xué) 2013



本文編號(hào)：3674616