一、MEKK2參與T細胞受體信號中JNK激活和IL-2基因表達 JNK（c-Jun N-terminal kinases）是MAPK（mitogen-activated protein kinase）家族基因的成員，對細胞增殖、分化和凋亡十分重要。以前的研究發(fā)現(xiàn)T細胞JNK激活需要T細胞受體和輔助受體如CD28的共刺激。本研究探討MEKK2是否是T細胞中特異的JNK上游活化激酶，是否涉及轉(zhuǎn)導(dǎo)來自TCR／CD3的T細胞信號激活JNK MAPK級聯(lián)和T細胞特異基因IL-2的表達。利用多組織poly（A）雜交模板，用1kb N-末端人MEKK2做探針行Northern雜交。Jurkat T-細胞用電擊法轉(zhuǎn)染，COS-1細胞用Lipo-fectamine轉(zhuǎn)染檢測不同的基因表達或作用�？笿NK抗體免疫沉淀法，GST-cJun為作用底物體外檢測JNK激酶活性；抗HA抗體、GST-JNKK2為作用底物體外檢測MEKK2激酶活性。熒光酶報告基因檢測IL-2和AP—1基因的表達。抗HA抗體12CA5、抗MEKK2抗體11281129、抗磷酸化抗體Pty20和ECL試劑盒進行蛋白印跡檢測。 N... 

【文章頁數(shù)】：127 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
第一部分：MEKK2參與T細胞受體信號中JNK激活和IL-2基因表達
    一、前言
    二、材料和方法
        1.質(zhì)粒、蛋白和抗體
        2.Northern雜交
        3.細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
        4.體外激酶JNK和MEKK2活性測定
            免疫沉淀法檢測JNK激酶活性
            免疫沉淀法檢測MEKK2激酶活性
        5.熒光酶報告基因檢測
        6.蛋白印跡
    三、結(jié)果
        1.T細胞中MEKK2激活JNK級聯(lián)
        2.MEKK2參與轉(zhuǎn)導(dǎo)T細胞TCR／CD3信號
        3.抗CD3抗體刺激時MEKK2的酪氨酸磷酸化
        4.T細胞共刺激中JNK激活和IL-2基因表達需要MEKK2參與
    四、討論
    五、小結(jié)
    參考文獻
第二部分：小鼠MEKK2基因損毀揭示其在T細胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起特殊調(diào)制作用
    一、前言
    二、材料和方法
        1.基因打靶制備MEKK2缺陷小鼠
        2.免疫沉淀和蛋白印跡方法分析
        3.T細胞制備和純化
        4.流式儀分析T細胞和B細胞亞群
        5.細胞增值檢測
        6.ELISA測定細胞因子
        7.體內(nèi)胸腺細胞死亡檢測
        8.體外細胞凋亡檢測
        9.免疫印跡法檢測磷酸化JNK、ERK和p38
        10.洗脫和再雜交檢測JNK、ERK和p38蛋白
    三、結(jié)果
        1.同源重組損壞MEKK2基因及表達
        2.MEKK2突變型小鼠表型
        3.MEKK2的損壞不改變正常的T細胞、B細胞發(fā)展
        4.MEKK2缺陷T細胞在抗CD3單抗刺激時增殖顯著
        5.MEKK2缺陷型T細胞細胞因子表達的改變
        6.MEKK2保護胸腺細胞抵抗激活誘導(dǎo)細胞死亡的作用
            1.抗CD3抗體體內(nèi)誘導(dǎo)胸腺細胞凋亡
            2.培養(yǎng)條件下胸腺細胞的自發(fā)凋亡
            3.抗CD3抗體體外誘導(dǎo)胸腺細胞凋亡
            4.UV誘導(dǎo)胸腺細胞凋亡
            5.抗Fas抗體誘導(dǎo)胸腺細胞凋亡
            6.Dex誘導(dǎo)的胸腺細胞凋亡
        7.MEKK2損壞不阻斷TCR介導(dǎo)的JNK、ERK和p38的激活
    四、討論
    五、小結(jié)
    參考文獻
第三部分：激素對人肺成纖維細胞MAPK信號傳導(dǎo)途徑的作用
    一、前言
    二、材料和方法
        1.儀器和試劑
        2.細胞培養(yǎng)和處理
        3.細胞增殖試驗
        4.流式細胞儀分析細胞周期
        5.蛋白印跡檢測JNK、ERK和p38蛋白的磷酸化
        6.膜抗體洗脫再雜交
        7.蛋白印跡檢測JNK、ERK和p38
    三、結(jié)果
        1.地塞米松抑制肺成纖維細胞增殖
        2.地塞米松阻斷肺成纖維細胞的細胞周期
        3.激素對JNK的作用
        4.激素對ERK的作用
        5.激素對p38的作用
    四、討論
    五、小結(jié)
    參考文獻
綜述一：絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)及其作用機制
    一、引言
    二、MAPK途徑的發(fā)現(xiàn)
    三、MAPK途徑基本特點
        1.三酶級聯(lián)反應(yīng)
        2.MAPK的雙磷酸化激活
    四、ERK MAPK級聯(lián)
        1.激活因素
        2.三酶模體構(gòu)成
        3.作用底物
        4.途徑功能
        5.ERK途徑的調(diào)節(jié)
    五、JNK MAPK級聯(lián)
        1.激活因素
        2.三酶模體構(gòu)成
        3.作用底物
        4.途徑功能
    六、P38 MAPK級聯(lián)
        1.激活因素
        2.三酶模體構(gòu)成
        3.作用底物
        4.途徑功能
    七、MAPK對基因表達的調(diào)控
    八、MAPK途徑特異性的實現(xiàn)
        1.酶—底物相互作用
        2.分子平臺
        3.胞內(nèi)作用的空間位置
        4.胞內(nèi)作用的時間順序
        5.信號的交叉與整合
    九、MAPK和淋巴細胞的激活
    十、結(jié)語
    參考文獻
綜述二：核受體和輔調(diào)因子對基因表達的組合調(diào)控——核受體和輔調(diào)因子的相互作用
    一、核受體超家族的基本結(jié)構(gòu)
    二、核受體的激活功能區(qū)
    三、核受體輔激活子
    四、幾種輔激活子與核受體的作用
        1.雄激素受體相關(guān)蛋白70
        2.中性粒細胞募集抑制因子3
        3.CBP/p300相互作用轉(zhuǎn)激活子
        4.選擇性雌激素受體調(diào)制子
    五、核受體輔阻遏子
    六、幾種輔阻遏子與核受體的相互作用
        1.SMRT與RXR的作用
        2.過氧化體增殖子激活受體δ
        3.雌激素受體活性阻遏子
    參考文獻
縮略語表
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]糖皮質(zhì)激素快速激活PC12細胞Erk1/2 MAPK[J]. 邱儉,王平,裴鋼,陳宜張.  中國病理生理雜志. 2000(10)



本文編號：3669098