第一部分氣道上皮細胞中機械劃傷致IQGAP1磷酸化對損傷修復的影響實驗背景:由于氣道（氣管和支氣管）粘膜暴露于外界環(huán)境,易受到損傷。氣道上皮受損后將立即啟動修復過程,從而保持正常的肺功能。這個損傷修復過程需要氣道上皮細胞伸展,遷移和增生最終覆蓋受損區(qū)域。氣道受損是氣道疾病例如慢性支氣管炎和COPD的重要的發(fā)病過程。因此氣道上皮自身的修復能力是解決這些氣道疾病的關鍵步驟。然而,參與氣道上皮損傷修復的分子機制尚未完全明了。IQGAP1（IQ domain GTPase-activating protein）在許多細胞生命活動中是一個非常有意義的蛋白,但是尚未有人闡述其在氣道上皮損傷修復中的作用。磷酸化作為翻譯后的主要手段,參與調(diào)節(jié)蛋白質及細胞骨架的功能。有報導顯示,IQGAP1絲氨酸殘基能被高磷酸化,結果能促進神經(jīng)元軸突外生性生長。PKC的一個新的亞型PKCε可能有助于IQGAP1的磷酸化。我們推測,在氣道上皮損傷修復過程中IQGAP1磷酸化可能發(fā)揮重要作用。目的:使用目前廣泛應用的刮傷氣道上皮細胞的體外模型,初步探討機械劃傷后IQGAP1的磷酸化水平以及對損傷修復的影響。方法:建立機械劃... 

【文章來源】：華中科技大學湖北省211工程院校985工程院校教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【部分圖文】：

pcDNA3-PKCε（HAtag）質粒圖

圖 2. IQGAP1 在氣道上皮中的表達和定位左：小鼠（a，支氣管）、大鼠（b，支氣管）、豬（c，細支氣管）和人（d，支氣管）的鮮肺組織標本被固定和石蠟包埋。采用免疫組化 S-P 法檢測了 IQGAP1 的表達。黑色箭頭代IQGAP1 的表達。每次實驗至少在三例標本中重復且每種條件下至少取 5 個視野以證實重復性放大倍數(shù)×200，DAB 顯色。Scale bar，50 μm。右：機械劃傷或 nocodazole（5 μg/mL）處理 30 m后，16HBE14o-細胞被固定且與相應抗體孵育，接著用 FITC-和 TRIFC-標記的二抗反應。對照中細胞不進行處理。圖像從激光共聚焦顯微鏡獲取。顯示的圖像是每種條件下至少 5 個視野中選出。Scale bar，10 μm。二、機械劃傷后氣道上皮的形態(tài)學特點相差顯微鏡下觀察，培養(yǎng)的氣道上皮細胞呈現(xiàn)上皮細胞典型的鋪路石狀形態(tài)，特點是立體的，稍微凸起的，細胞間緊密連接（圖 3 a）。在機械性損傷后，氣道皮細胞可成片狀的單向遷移，且其遷移方向垂直于劃痕方向。損傷 6 h 是細胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，形成具有特征性的極化形態(tài)學改變（圖 3 b），損傷 12 h 更為顯著（3 c）。損傷 24 h 后遷移的氣道上皮細胞能掩蓋劃線部分（圖 3 d）。

圖 2. IQGAP1 在氣道上皮中的表達和定位左：小鼠（a，支氣管）、大鼠（b，支氣管）、豬（c，細支氣管）和人（d，支氣管）的新鮮肺組織標本被固定和石蠟包埋。采用免疫組化 S-P 法檢測了 IQGAP1 的表達。黑色箭頭代表IQGAP1 的表達。每次實驗至少在三例標本中重復且每種條件下至少取 5 個視野以證實重復性。放大倍數(shù)×200，DAB 顯色。Scale bar，50 μm。右：機械劃傷或 nocodazole（5 μg/mL）處理 30 min后，16HBE14o-細胞被固定且與相應抗體孵育，接著用 FITC-和 TRIFC-標記的二抗反應。對照組中細胞不進行處理。圖像從激光共聚焦顯微鏡獲取。顯示的圖像是每種條件下至少 5 個視野中所選出。Scale bar，10 μm。二、機械劃傷后氣道上皮的形態(tài)學特點相差顯微鏡下觀察，培養(yǎng)的氣道上皮細胞呈現(xiàn)上皮細胞典型的鋪路石狀形態(tài)，其特點是立體的，稍微凸起的，細胞間緊密連接（圖 3 a）。在機械性損傷后，氣道上皮細胞可成片狀的單向遷移，且其遷移方向垂直于劃痕方向。損傷 6 h 是細胞形態(tài)即發(fā)生顯著改變，形成具有特征性的極化形態(tài)學改變（圖 3 b），損傷 12 h 更為顯著（圖3 c）。損傷 24 h 后遷移的氣道上皮細胞能掩蓋劃線部分（圖 3 d）。

【參考文獻】：
期刊論文
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[3]香煙煙霧提取物對氣道上皮細胞增殖和FIP200表達的影響[J]. 許麗,張珍祥,徐永健.  第四軍醫(yī)大學學報. 2005(19)
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[5]香煙煙霧提取物對豬氣道上皮細胞β-連環(huán)素及酪氨酸磷酸化的影響[J]. 陳芳,吳人亮,王曦,郝天玲.  中華醫(yī)學雜志. 2001(07)
[6]上皮鈣粘附素在吸煙小鼠呼吸道上皮損傷修復中表達的研究[J]. 許三林,吳人亮,陳春蓮,郝春榮.  中華結核和呼吸雜志. 1999(07)



本文編號：3614200