第一部分氣道上皮細(xì)胞中機(jī)械劃傷致IQGAP1磷酸化對(duì)損傷修復(fù)的影響實(shí)驗(yàn)背景:由于氣道（氣管和支氣管）粘膜暴露于外界環(huán)境,易受到損傷。氣道上皮受損后將立即啟動(dòng)修復(fù)過程,從而保持正常的肺功能。這個(gè)損傷修復(fù)過程需要?dú)獾郎掀ぜ?xì)胞伸展,遷移和增生最終覆蓋受損區(qū)域。氣道受損是氣道疾病例如慢性支氣管炎和COPD的重要的發(fā)病過程。因此氣道上皮自身的修復(fù)能力是解決這些氣道疾病的關(guān)鍵步驟。然而,參與氣道上皮損傷修復(fù)的分子機(jī)制尚未完全明了。IQGAP1（IQ domain GTPase-activating protein）在許多細(xì)胞生命活動(dòng)中是一個(gè)非常有意義的蛋白,但是尚未有人闡述其在氣道上皮損傷修復(fù)中的作用。磷酸化作為翻譯后的主要手段,參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)及細(xì)胞骨架的功能。有報(bào)導(dǎo)顯示,IQGAP1絲氨酸殘基能被高磷酸化,結(jié)果能促進(jìn)神經(jīng)元軸突外生性生長。PKC的一個(gè)新的亞型PKCε可能有助于IQGAP1的磷酸化。我們推測,在氣道上皮損傷修復(fù)過程中IQGAP1磷酸化可能發(fā)揮重要作用。目的:使用目前廣泛應(yīng)用的刮傷氣道上皮細(xì)胞的體外模型,初步探討機(jī)械劃傷后IQGAP1的磷酸化水平以及對(duì)損傷修復(fù)的影響。方法:建立機(jī)械劃... 

【文章來源】：華中科技大學(xué)湖北省211工程院校985工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

pcDNA3-PKCε（HAtag）質(zhì)粒圖

圖 2. IQGAP1 在氣道上皮中的表達(dá)和定位左：小鼠（a，支氣管）、大鼠（b，支氣管）、豬（c，細(xì)支氣管）和人（d，支氣管）的鮮肺組織標(biāo)本被固定和石蠟包埋。采用免疫組化 S-P 法檢測了 IQGAP1 的表達(dá)。黑色箭頭代IQGAP1 的表達(dá)。每次實(shí)驗(yàn)至少在三例標(biāo)本中重復(fù)且每種條件下至少取 5 個(gè)視野以證實(shí)重復(fù)性放大倍數(shù)×200，DAB 顯色。Scale bar，50 μm。右：機(jī)械劃傷或 nocodazole（5 μg/mL）處理 30 m后，16HBE14o-細(xì)胞被固定且與相應(yīng)抗體孵育，接著用 FITC-和 TRIFC-標(biāo)記的二抗反應(yīng)。對(duì)照中細(xì)胞不進(jìn)行處理。圖像從激光共聚焦顯微鏡獲取。顯示的圖像是每種條件下至少 5 個(gè)視野中選出。Scale bar，10 μm。二、機(jī)械劃傷后氣道上皮的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)相差顯微鏡下觀察，培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞呈現(xiàn)上皮細(xì)胞典型的鋪路石狀形態(tài)，特點(diǎn)是立體的，稍微凸起的，細(xì)胞間緊密連接（圖 3 a）。在機(jī)械性損傷后，氣道皮細(xì)胞可成片狀的單向遷移，且其遷移方向垂直于劃痕方向。損傷 6 h 是細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，形成具有特征性的極化形態(tài)學(xué)改變（圖 3 b），損傷 12 h 更為顯著（3 c）。損傷 24 h 后遷移的氣道上皮細(xì)胞能掩蓋劃線部分（圖 3 d）。

圖 2. IQGAP1 在氣道上皮中的表達(dá)和定位左：小鼠（a，支氣管）、大鼠（b，支氣管）、豬（c，細(xì)支氣管）和人（d，支氣管）的新鮮肺組織標(biāo)本被固定和石蠟包埋。采用免疫組化 S-P 法檢測了 IQGAP1 的表達(dá)。黑色箭頭代表IQGAP1 的表達(dá)。每次實(shí)驗(yàn)至少在三例標(biāo)本中重復(fù)且每種條件下至少取 5 個(gè)視野以證實(shí)重復(fù)性。放大倍數(shù)×200，DAB 顯色。Scale bar，50 μm。右：機(jī)械劃傷或 nocodazole（5 μg/mL）處理 30 min后，16HBE14o-細(xì)胞被固定且與相應(yīng)抗體孵育，接著用 FITC-和 TRIFC-標(biāo)記的二抗反應(yīng)。對(duì)照組中細(xì)胞不進(jìn)行處理。圖像從激光共聚焦顯微鏡獲取。顯示的圖像是每種條件下至少 5 個(gè)視野中所選出。Scale bar，10 μm。二、機(jī)械劃傷后氣道上皮的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)相差顯微鏡下觀察，培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞呈現(xiàn)上皮細(xì)胞典型的鋪路石狀形態(tài)，其特點(diǎn)是立體的，稍微凸起的，細(xì)胞間緊密連接（圖 3 a）。在機(jī)械性損傷后，氣道上皮細(xì)胞可成片狀的單向遷移，且其遷移方向垂直于劃痕方向。損傷 6 h 是細(xì)胞形態(tài)即發(fā)生顯著改變，形成具有特征性的極化形態(tài)學(xué)改變（圖 3 b），損傷 12 h 更為顯著（圖3 c）。損傷 24 h 后遷移的氣道上皮細(xì)胞能掩蓋劃線部分（圖 3 d）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]細(xì)胞質(zhì)連接蛋白-170在小鼠氣道上皮損傷修復(fù)過程中的動(dòng)態(tài)變化[J]. 馬燕,李娜萍,吳人亮,劉明閣,洪淵智,朱敏,田丹.  華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2007(01)
[3]香煙煙霧提取物對(duì)氣道上皮細(xì)胞增殖和FIP200表達(dá)的影響[J]. 許麗,張珍祥,徐永健.  第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2005(19)
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[5]香煙煙霧提取物對(duì)豬氣道上皮細(xì)胞β-連環(huán)素及酪氨酸磷酸化的影響[J]. 陳芳,吳人亮,王曦,郝天玲.  中華醫(yī)學(xué)雜志. 2001(07)
[6]上皮鈣粘附素在吸煙小鼠呼吸道上皮損傷修復(fù)中表達(dá)的研究[J]. 許三林,吳人亮,陳春蓮,郝春榮.  中華結(jié)核和呼吸雜志. 1999(07)



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