本文關(guān)鍵詞：染矽塵大鼠早期肺組織差異基因表達(dá)譜及手掌參醇提取物對(duì)其影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】： 矽肺是由于長(zhǎng)期吸入大量含游離二氧化硅粉塵而引起的以肺間質(zhì)纖維化為主要病變的全身性疾病,在我國(guó)屬于法定職業(yè)病。1991～2002年我國(guó)職業(yè)病發(fā)病總數(shù)呈現(xiàn)明顯的凹形反彈趨勢(shì)。發(fā)病人數(shù)從20世紀(jì)90年代初的每年2.2萬(wàn)人逐步下降,1997年最低降至1萬(wàn)人后又呈反彈,2002年達(dá)1.5萬(wàn)人,其中主要是塵肺檢出率顯著回升,發(fā)病形勢(shì)依然嚴(yán)重。衛(wèi)生部公布的2006年全國(guó)共診斷各類職業(yè)病報(bào)告11519例,其中塵肺病8783例,占診斷職業(yè)病病例總數(shù)的76.25%。2006年職業(yè)病報(bào)告具有以下特點(diǎn):塵肺病例比例增加,發(fā)病時(shí)間縮短,發(fā)病年齡趨于年輕化,未成年工職業(yè)健康損害嚴(yán)重。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),截至2006年全國(guó)累計(jì)報(bào)告職業(yè)病676,562例,其中:塵肺病累計(jì)發(fā)病616,442例,死亡146,195例,現(xiàn)患470,247例;近15年平均每年新發(fā)塵肺病人近1萬(wàn)例。據(jù)報(bào)道,塵肺病每年對(duì)國(guó)家造成的直接經(jīng)濟(jì)損失約90億元人民幣,間接經(jīng)濟(jì)損失無(wú)法估計(jì)。而矽肺患者占了塵肺病例的近80%,表明矽肺是塵肺中危害最嚴(yán)重的職業(yè)病。而且,停止粉塵暴露,塵肺病依然進(jìn)展;高濃度暴露,發(fā)病工齡縮短,發(fā)病年齡趨于年輕化,病情嚴(yán)重,死亡率高。并且,隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,大量農(nóng)村務(wù)工人員參與無(wú)防護(hù)措施的接塵工作,接觸粉塵作業(yè)的人群還在急劇上升。ILO和WHO共同提出全球消除矽肺計(jì)劃,在2010年使矽肺的發(fā)病率顯著降低,到2030年完全消除矽肺。我國(guó)是塵肺大國(guó),塵肺病人數(shù)、接觸粉塵作業(yè)人數(shù)都居世界首位。直至目前,矽肺的發(fā)病機(jī)理仍然不完全清楚,無(wú)早期診斷的特異性指標(biāo)。一經(jīng)傳統(tǒng)的后前位胸大片確診,肺部病變已經(jīng)無(wú)法逆轉(zhuǎn)。而且也無(wú)特異性的治療藥物和方法,我國(guó)防治矽肺的藥物主要有克矽平、磷酸喹哌、羥基喹哌、檸檬酸鋁、矽肺寧、漢防己甲素以及某些中藥等,但大多有一定的毒副作用。因此,研究矽肺早期病理機(jī)制,及尋找一種安全有效、低毒的新型抗纖維化藥物,在矽肺病研究中已成為迫切需要解決的問(wèn)題。 研究目的 為探討矽肺發(fā)生及中藥(手掌參)干預(yù)后的分子機(jī)制,以染矽塵大鼠為研究對(duì)象進(jìn)行肺組織基因表達(dá)譜的比較分析,并初步對(duì)差異基因的功能進(jìn)行探討,以期從基因水平上揭示矽肺發(fā)生的分子機(jī)制,也為進(jìn)一步探索更加有效、低毒的防治藥物提供基礎(chǔ)。 研究方法 2.1動(dòng)物模型建立與處理 本研究設(shè)定四個(gè)組,分別為對(duì)照組、染矽塵組、手掌參組(模型治療組)和漢防己組(標(biāo)準(zhǔn)藥物治療組)。本研究采用SPF級(jí)近交群雄性Wistar大鼠,隨機(jī)將大鼠分為四組,每組40只。 染矽塵組與各治療組采用氣管暴露法,每只大鼠氣管內(nèi)注入濃度為50mg/ml的矽塵滅菌混懸液1ml,對(duì)照組注入0.9%NaCl注射液。染矽塵建模后第二天,手掌參組按手掌參提取物0.8g/100g的量給予,每天灌胃;漢防己組按漢防己甲素液5mg/100g的量給予,隔天灌胃;對(duì)照組、染矽塵組給予蒸餾水2ml,每天灌胃,如此直到將動(dòng)物處死。以建模術(shù)時(shí)為0d記,模型建立后7d、14d、21d、28d和60d的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取8只大鼠處死,并將肺組織迅速投入液氮待用。采用HE染色和天狼猩紅染色法,分別觀察矽肺結(jié)節(jié)和Ⅰ、Ⅲ型膠原,并用Image-Pro Plus Version 4.5 for windowsTM圖像分析系統(tǒng)對(duì)Ⅰ、Ⅲ型膠原進(jìn)行定量。 2.2基因芯片檢測(cè)差異基因表達(dá)譜 應(yīng)用Illumina激光共聚焦光纖微珠基因芯片分析平臺(tái),經(jīng)RNA擴(kuò)增和標(biāo)記、芯片雜交,并用BeadStation500激光共聚焦掃描系統(tǒng)進(jìn)行掃描;用BeadStudio分析軟件將掃描獲取的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理,使用Illumina自行開發(fā)的算法求Diffscore值,比較一種基因探針在兩種組織中的表達(dá)差異程度。 采用DAVID生物信息學(xué)分析工具,采用Fisher精確概率檢驗(yàn),對(duì)差異基因的基因功能和生物學(xué)通路進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)富集分析。并用realrime-PCR的方法對(duì)差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。 研究結(jié)果 3.1染矽塵動(dòng)物模型 HE染色:在本次研究的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)中,在注入矽塵后14d時(shí)動(dòng)物出現(xiàn)明顯變化,故本研究選用14d進(jìn)行差異基因研究。主要表現(xiàn)為肺泡腔內(nèi)肉芽腫進(jìn)行性纖維化,成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增生并平行排列,肺泡壁增厚,可見(jiàn)膠原纖維積聚,肺泡結(jié)構(gòu)破壞,出現(xiàn)斑片狀纖維化。細(xì)胞結(jié)節(jié)數(shù)量多,體積大,可見(jiàn)巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞及反應(yīng)性肺氣腫。手掌參組HE染色結(jié)果介于矽塵組與對(duì)照組之間,肺泡炎和纖維化均有不同程度的減輕。 3.2基因芯片檢測(cè)篩選染矽塵大鼠早期肺組織差異基因表達(dá)譜本次芯片檢測(cè)出的有效基因?yàn)?2 107個(gè),按照差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn),篩選出染矽塵組與對(duì)照組的差異基因共1 567個(gè),其中上調(diào)基因762個(gè),下調(diào)基因799個(gè)。 對(duì)基因功能進(jìn)行分類,上調(diào)基因分為35個(gè)基因功能簇,下調(diào)基因分為20個(gè)基因功能簇,主要涉及:(1)細(xì)胞生命生化反應(yīng)相關(guān)基因,包括細(xì)胞周期、細(xì)胞分化和增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、傳遞、氧化應(yīng)激反應(yīng)、DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)、熱休克蛋白等與毒性機(jī)制相關(guān)的基因;(2)與DNA、RNA和蛋白代謝,及與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等生物過(guò)程相關(guān)的基因;(3)與氧化還原酶、氧化磷酸酶、水解酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、蛋白激酶等分子功能相關(guān)基因;(4)以及細(xì)胞因子、趨化因子及免疫反應(yīng)相關(guān)的基因等。按生物通路分析,萜類化合物、類固醇、ATP的生物合成、核黃素代謝等通路相關(guān)基因表達(dá)上調(diào);而Wnt、TGF-β信號(hào)途徑及淋巴細(xì)胞向內(nèi)皮遷移通路相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)。用real-time-PCR方法對(duì)SOD2和HMOX1基因進(jìn)行驗(yàn)證,與基因芯片基因上調(diào)的趨勢(shì)是一致的。 3.3手掌參醇提取物對(duì)染矽塵早期大鼠肺組織差異基因表達(dá)譜的影響手掌參醇提取物對(duì)矽肺進(jìn)程有逆轉(zhuǎn)作用的差異表達(dá)基因共539個(gè),其中上調(diào)基因308個(gè),下調(diào)基因231個(gè)。按生物通路分析,與細(xì)胞粘附、Notch信號(hào)途徑、淋巴細(xì)胞向內(nèi)皮遷移、背腹軸形成、細(xì)胞通訊等通路相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào),與補(bǔ)體和凝血連鎖、造血細(xì)胞系、尿素循環(huán)、阿耳茨海默病相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)。用real-time-PCR方法對(duì)SOD2和HMOX1基因進(jìn)行驗(yàn)證,與基因芯片基因上調(diào)的趨勢(shì)是一致的。 研究結(jié)論 本次芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲取了染矽塵早期的差異基因表達(dá)譜,從生物信息學(xué)角度群體分析了差異基因表達(dá)譜,將眾多與矽肺相關(guān)的基因分為若干功能相關(guān)的群體簇進(jìn)行研究,這些差異基因主要涉及細(xì)胞周期、細(xì)胞分化增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、傳遞、氧化應(yīng)激反應(yīng)、DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)、熱休克蛋白等毒理相關(guān)基因;與DNA、RNA和蛋白代謝,及與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等生物進(jìn)程相關(guān)基因;與氧化還原酶、氧化磷酸酶、水解酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、蛋白激酶等分子功能相關(guān)基因;以及細(xì)胞因子、趨化因子及免疫反應(yīng)相關(guān)基因,由于篇幅所限,未對(duì)其一一進(jìn)行討論。差異基因功能分類的結(jié)果提示染矽塵早期可能存在復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。而手掌參提取物成分復(fù)雜,活性并不單一,可能多環(huán)節(jié)干預(yù)纖維化的形成,其作用機(jī)制可能是:(1)抗氧自由基;(2)抗RNS;(3)緩解血管損傷;(4)抑制淋巴細(xì)胞向內(nèi)皮遷移。 綜上所述,本研究為進(jìn)一步研究矽肺發(fā)病早期基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,發(fā)現(xiàn)手掌參的藥靶基因及早期生物標(biāo)志物提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和研究方向。
【關(guān)鍵詞】：矽肺 手掌參 基因表達(dá)譜 大鼠 肺
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R135.21
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照6-10
• 中文摘要10-15
• 英文摘要15-21
• 論文正文：染矽塵大鼠早期肺組織差異基因表達(dá)譜及手掌參醇提取物對(duì)其影響的研究21-80
• 前言21-27
• 參考文獻(xiàn)25-27
• 第一部分 染矽塵大鼠模型的建立及手掌參處理常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)27-42
• 1 材料與方法27-28
• 2 技術(shù)路線圖28
• 3 實(shí)驗(yàn)方法28-34
• 4 結(jié)果34-38
• 5 討論38-41
• 參考文獻(xiàn)41-42
• 第二部分 染矽塵大鼠早期肺組織差異基因表達(dá)譜及手掌參醇提取物對(duì)其影響的研究42-78
• 1 材料與方法42-43
• 2 技術(shù)路線圖43
• 3 實(shí)驗(yàn)方法43-51
• 4 結(jié)果51-66
• 5 討論66-75
• 參考文獻(xiàn)75-78
• 全文總結(jié)78-80
• 附圖80-86
• 附表86-132
• 文獻(xiàn)綜述：基因表達(dá)譜微陣列技術(shù)在肺纖維化疾病研究中的應(yīng)用132-143
• 致謝143-144
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文144

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本文編號(hào)：350862