發(fā)布時間：2017-04-26 12:13

  本文關(guān)鍵詞：線粒體DNA抑制脂多糖誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)及相關(guān)機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一、 研究背景在美國,創(chuàng)傷是青年的頭號死亡原因。盡管一些患者可以在創(chuàng)傷的早期幸存,但是他們往往需要面臨另一個挑戰(zhàn),即肺部感染和急性呼吸窘迫綜合癥。(Acute respiratory disease syndrome,ARDS)。ARDS的發(fā)病機制涉及多個環(huán)節(jié),既往研究在ARDS發(fā)生發(fā)展機制領(lǐng)域取得了一些進展,但其具體機制目前仍然沒有完全闡明。ARDS的核心機制是全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome,SIRS),各種致傷因子通過SIRS導(dǎo)致ARDS。在對以SIRS為核心的ARDS發(fā)生機制的研究中發(fā)現(xiàn)：感染和非感染的刺激可以分別通過病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)作用于模式識別受體(pattern recognition Receptors,PRRs),繼而促進炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌,介導(dǎo)瀑布式炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致ARDS的發(fā)生。過去的研究顯示,創(chuàng)傷后呼吸機相關(guān)肺炎(ventilator-associated pneumonia,VAP)與高死亡率和ICU住院時間延長有關(guān)。雖然我們目前已發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的損傷和受損的免疫反應(yīng)相關(guān),但是對損傷引起的免疫抑制的原因及機制還知之甚少。DAMPs/PAMPs作用于PRRs在IL-1β的合成和釋放中扮演重要角色。目前已發(fā)現(xiàn)的PRRs主要分為以下三類：Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)、 RIG-I樣受體(retinoic acid-inducible gene-I [RIG-I]-like receptors,RLRs)和NOD樣受體(nucleotide binging oligomerization domain[NOD]-like receptors, NLRs)。胞外刺激物主要是通過TLRs作用于細(xì)胞介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的。到目前為止,已發(fā)現(xiàn)了13種TLRs,它們中的大部分被深入研究并且發(fā)現(xiàn)它們各自的配體。像TLR-2介導(dǎo)識別包括脂蛋白、脂肽、脂磷壁酸等微生物成分。TLR-9主要被含有CpGDNA的細(xì)菌,一些雙鏈DNA病毒和人工合成的CpG核苷酸刺激。巨噬細(xì)胞在誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)肺部炎癥時的免疫反應(yīng)中起到重要作用。它能識別病原微生物并分泌TNF-a,IL-6 and IL-1β等促炎因子。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性桿菌細(xì)胞壁的重要組成部分,重要的PAMPs,可以作用于巨噬細(xì)胞,通過NF-kB介導(dǎo)炎癥因子的合成和釋放。LPS耐受,是指機體接受小劑量LPS刺激后,對LPS的再刺激表現(xiàn)出低反應(yīng)的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象常常在創(chuàng)傷后期免疫抑制繼發(fā)膿毒血癥的患者中發(fā)現(xiàn)。近年來,我們對LPS耐受機制和LPS再刺激誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞敏感性降低的認(rèn)識不斷提高,對LPS的信號通路也有了更為深刻的理解。廣義的內(nèi)毒不特指LPS的預(yù)刺激所誘發(fā)的對LPS的耐受。研究表明LPS是通過眾多PRRs中的TLR4啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的。研究發(fā)現(xiàn),不同微生物刺激通過不同的TLR介導(dǎo)。而且研究還發(fā)現(xiàn),除了TLR4配體,其他TLRs的刺激物預(yù)處理巨噬細(xì)胞也可以產(chǎn)生對LPS的交互耐受。目前已經(jīng)報道的有TLR-2, TLR-4, TLR-5,TLR-9,它們能誘導(dǎo)對同種刺激物再刺激的低反應(yīng)。除此之外,還發(fā)現(xiàn)通過TLR-2和TLR4以及TLR-4和TLR-9的刺激物可以相互替代,誘導(dǎo)交互耐受的發(fā)生。線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)與核DNA(bDNA)起源和進化有很大差異。目前主流學(xué)說認(rèn)為線粒體DNA來源于細(xì)菌DNA,它在體內(nèi)與真核生物共生最終進化而成細(xì)胞器。與細(xì)菌DNA一樣,mtDNA富含去甲基化的CpG序列,可以激活機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。因此,mtDNA作為重要的DAMPs,其致炎機制也備受關(guān)注。目前的文獻(xiàn)資料顯示,CpG單核苷酸通過TLR9受體,介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)磷酸化上調(diào)NF-kB而進一步誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。在不同類型細(xì)胞中,CpG單核苷酸作用于相應(yīng)的MAPKs并刺激不同的下游炎癥因子或趨化因子的產(chǎn)生。MAPK級聯(lián)激活是多種信號通路的中心,是接收膜受體轉(zhuǎn)換與傳遞的信號并將其帶入細(xì)胞核內(nèi)的一類重要分子。在未受刺激的細(xì)胞內(nèi),MAPK處于靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到生長因子或其他因素刺激后,MAPK接到MAPK激酶激酶和MAPK激酶的活化信號后被激活,表現(xiàn)為逐級磷酸化。而且,p38MAPK還是LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的重要因子。mtDNA預(yù)處理會對LPS刺激誘導(dǎo)的p38 MAPK有什么影響,目前還無相關(guān)研究結(jié)果說明。近年來,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷、休克等釋放的內(nèi)源性mtDNA可以作為重要的DAMPs通過TLR9作用于巨噬細(xì)胞。新近有研究發(fā)現(xiàn),肺部損傷可以引起中性粒細(xì)胞向肺部轉(zhuǎn)移,而向腹腔內(nèi)注射mtDAMPs可以刺激腹部創(chuàng)傷,同時誘發(fā)中性粒細(xì)胞聚集。但是此時肺部中性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)向腹部移動,腹腔內(nèi)注射mtDAMPs并沒有和中性粒細(xì)胞協(xié)同刺激肺部炎癥,反而使得肺部中性粒細(xì)胞移除肺組織。當(dāng)從損傷、死亡或壞死組織釋放時,中性粒細(xì)胞向肺部感染趨化的正常反應(yīng)會減弱,提示肺部的趨化因子可能下降。這使得肺的免疫防御能力下降,更容易受到病原體損害。這種新機制的發(fā)現(xiàn)可能可以解釋系統(tǒng)組織創(chuàng)傷、肺炎和膿毒血癥的關(guān)系。這種線粒體DAMPs預(yù)處理抑制繼發(fā)于肺挫傷的肺部炎癥反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)提示mtDNA可能通過某種機制誘導(dǎo)免疫抑制。二、研究目的目前mtDNA對LPS的交互耐受作用尚不明確,本研究通過體內(nèi)和體外實驗探索mtDNA對LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)的抑制作用,闡明mtDNA預(yù)處理對LPS的耐受作用,對mtDNA在炎癥反應(yīng)中的作用進行深入探索,以期輔助炎性疾病的診治。三、研究方法1、外源性mtDNA的獲得：培養(yǎng)THP-1細(xì)胞,收集并提取THP-1細(xì)胞的mtDNA;取小鼠肝臟,充分研磨提取鼠mtDNA。并用分光光度計檢測其濃度,并用熒光實時定量PCR(real-timePCR, RT-PCR)檢測核基因GAPDH(人),18S(鼠),排除可能混雜核基因感染的干擾。2、刺激分化的THP-1細(xì)胞并檢測：先用PMA處理細(xì)胞24h,誘導(dǎo)細(xì)胞分化。用不同濃度的ntDNA(0.1ug/ml,1 ug/ml, 5 ug/ml,10 ug/ml,20 ug/ml)或1640培養(yǎng)基預(yù)處理分化的THP-1細(xì)胞2h或24h,后給予LPS (100ng/ml)刺激3h。通過ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)的變化。用最適ntDNA濃度刺激THP-1預(yù)處理細(xì)胞,再給予LPS(100ng/ml)刺激。通過RT-PCR檢測細(xì)胞中炎癥因子的mRNA表達(dá)情況。3. mtDNA刺激對LPS介導(dǎo)的p38 MAPK激活的影響：借助Westren Blot方法檢測mtDNA預(yù)處理和LPS再刺激前后,p38 MAPK的蛋白水平及磷酸化的差異。4、mtDNA預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠肺部炎癥的影響：將36只小鼠隨機分四組分別給予生理鹽水、LPS、mtDNA、mtDNA+LPS刺激,mtDNA腹腔注射刺激,通過氣管內(nèi)給藥的方式給予小鼠LPS(100ug/kg)刺激。LPS處理3h后處死小鼠,取肺組織。通過HE染色和免疫熒光觀察各組的肺組織病理變化,對比炎癥反應(yīng)輕重；測量肺濕干比。將肺組織研磨均勻,蛋白酶溶解并收集組織上清,用ELISA試劑盒檢測各組的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的蛋白水平。統(tǒng)計分析各組結(jié)果。四、實驗結(jié)果1、mtDNA預(yù)處理誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞對LPS的耐受：分化的THP-1細(xì)胞在不同濃度的mtDNA預(yù)處理24h,再受到LPS刺激后,釋放的炎癥因子TNF-a (5ug/ml mtDNA)、IL-1β(5ug/ml mtDNA)、IL-6(lOug/ml mtDNA)水平都下降了,而IL-8的蛋白水平變化無統(tǒng)計學(xué)差異。該結(jié)果表明mtDNA預(yù)處理可以抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子釋放。而不同濃度mtDNA預(yù)處理2h后給予LPS再刺激,各細(xì)胞因子的釋放增加,此時mtDNA和LPS表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。RT-PCR結(jié)果顯示,mtDNA 10ug/ml預(yù)處理THP-1細(xì)胞24h后,再給予LPS刺激可使LPS誘導(dǎo)的炎癥因子(TNF-a,IL-1β and IL-6)基因表達(dá)水平下降,而IL-8的基因水平無明顯變化。這個結(jié)果和細(xì)胞培養(yǎng)上清蛋白釋放結(jié)果一致。2.P38 MAPK在mtDNA誘導(dǎo)的LPS耐受中的作用：我們既往的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),mtDNA可以激活中性粒細(xì)胞的TLR9-p38 MAPK通路誘導(dǎo)無菌炎癥和ALI。而且P38 MAPK已被證實是LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的重要因子。我們通過Western Blot技術(shù)檢測小鼠肺組織的p38蛋白水平發(fā)現(xiàn),單獨給予mtDNA或LPS刺激都可以顯著誘導(dǎo)P38 MAPK上調(diào)和磷酸化,而對比未添加預(yù)處理的THP-1細(xì)胞,給予LPS刺激誘導(dǎo)的p38磷酸化在mtDNA預(yù)處理組顯著被抑制了。3、mtDNA預(yù)處理抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥：通過觀察4組小鼠的肺組織病理發(fā)現(xiàn),LPS組的小鼠肺部炎癥最重,mtDNA+LPS組小鼠的肺部炎癥較LPS組減輕,提示mtDNA預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥有抑制作用。通過比較各組小鼠肺的濕干比發(fā)現(xiàn),LPS處理組肺濕干比最大,而組mtDNA+LPS組有所減小。此外,我們還對肺組織研磨上清進行ELISA檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),mtDNA預(yù)處理可以顯著降低LPS誘導(dǎo)的TNF-a和IL-6釋放,但I(xiàn)L-1p和IL-8的釋放無明顯改變。五、結(jié)論：我們的研究表明mtDNA預(yù)處理THP-1細(xì)胞可以抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)和釋放,導(dǎo)致細(xì)胞的LPS耐受效應(yīng)的產(chǎn)生。而且,我們的結(jié)果還提示p38MAPK在mtDNA和LPS的交互耐受中有重要的作用。內(nèi)毒素耐受既可以降低過度炎癥反應(yīng),減少機體損傷；又可能導(dǎo)致免疫抑制,增加二次感染的風(fēng)險。內(nèi)毒素耐受及其與刺激物之間的量化關(guān)系,對診治炎癥相關(guān)疾病有重要的作用。我們將在未來的研究中進行更為廣泛和深入的探索
【關(guān)鍵詞】：mtDNA LPS LPS耐受 TLRs
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R563
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 參考文獻(xiàn)18-20
• 第一章 mtDNA預(yù)處理抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和釋放20-40
• 1. 實驗材料和方法20-32
• 1.1 實驗材料20-22
• 1.2 實驗方法22-32
• 1.3 統(tǒng)計分析32
• 2. 實驗結(jié)果32-36
• 2.1 mtDNA預(yù)處理誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞對LPS的交互耐受32-35
• 2.2 P38 MAPK在mtDNA誘導(dǎo)的LPS耐受中的作用35-36
• 3. 討論36-38
• 參考文獻(xiàn)38-40
• 第二章 mtDNA抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥反應(yīng)40-54
• 1. 實驗材料和方法40-45
• 1.1 實驗材料40-41
• 1.2 實驗方法41-45
• 1.3 統(tǒng)計分析45
• 2. 實驗結(jié)果45-49
• 2.1 mtDNA預(yù)處理可以抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠肺組織炎癥45-47
• 2.2 mtDNA預(yù)處理降低LPS誘導(dǎo)的小鼠肺濕干比升高47-48
• 2.3 mtDNA抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠肺組織細(xì)胞因子的釋放48-49
• 3. 討論49-52
• 參考文獻(xiàn)52-54
• 全文總結(jié)54-56
• 文獻(xiàn)綜述：線粒體相關(guān)的NLRP3炎性體激活56-64
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 附錄64-66
• 成果66-67
• 致謝67-68

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：328431