本文關(guān)鍵詞：TLR4與核仁素受體在呼吸道合胞病毒感染中樞神經(jīng)元所致?lián)p傷中的介導(dǎo)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《安徽醫(yī)科大學(xué)》 2015年

TLR4與核仁素受體在呼吸道合胞病毒感染中樞神經(jīng)元所致?lián)p傷中的介導(dǎo)作用

吳璇  

【摘要】：目的探討呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染中樞神經(jīng)元細(xì)胞(neuron2a.N2a),細(xì)胞膜上的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)和核仁素受體(Nucleolin,NCL或C23)的變化情況,研究TLR4和核仁素受體在RSV感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)所致?lián)p傷中的介導(dǎo)作用,為臨床RSV感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的預(yù)防和治療提供新的思路。方法以RSV感染體外培養(yǎng)的N2a細(xì)胞,并通過siRNA沉默TLR4、核仁素受體表達(dá),分別于感染后1、2、4、12、24和48 h不同時間點(diǎn)收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液。(1)激光共聚焦顯微鏡檢測TLR4、核仁素受體與RSV F蛋白結(jié)合情況,以及神經(jīng)核蛋白(NeuN)在N2a細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)目的表達(dá)變化；(2)用TRIzol法提取N2a細(xì)胞總RNA,通過實(shí)時熒光定量PCR法檢沏TLR4、C23 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平變化；(3)免疫印跡法(Western-blot)檢測各組不同時間點(diǎn)TLR3、TLR4、TLR7.C23以及NF-κB蛋白水平的表達(dá)變化；(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況；(5)空斑形成實(shí)驗(yàn)(plaque forming unit,PFU)檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中病毒增殖的滴度；(6)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8和TNF-α炎癥因子的表達(dá)。結(jié)果(1)激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示,TLR4和C23受體在N2a細(xì)胞膜表面可以結(jié)合RSV F蛋白,在RSV感染1、2和4 h的入胞過程中,隨著感染時間點(diǎn)的延長,F蛋白與TLR4和C23的結(jié)合逐漸增加；TLR4被干擾后,RSV F蛋白標(biāo)記的藍(lán)色熒光表達(dá)強(qiáng)度較RSV感染組和C23 siRNA組降低,表明TLR4與F蛋白結(jié)合減少,RSV在N2a細(xì)胞內(nèi)增殖能力減弱；C23受體沉默后,核仁素受體與F蛋白結(jié)合減少,但可見TLR4結(jié)合更多F蛋白,提示TLR4可結(jié)合更多的RSV進(jìn)入N2a細(xì)胞增殖；RSV感染組中N2a細(xì)胞中NeuN標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)目較TLR4siRNA、C23 siRNA組的陽性細(xì)胞數(shù)目明顯降低。(2)在mRNA轉(zhuǎn)錄水平,TLR4和C23在感染1-4 h的入胞過程表達(dá)量逐漸增高,4 h后表達(dá)量降低,說明TLR4和C23在細(xì)胞膜上識別RSV入胞過程中具有重要的作用；在瞬時轉(zhuǎn)染TLR4 siRNA后,TLR4和C23蛋白的表達(dá)雖有上調(diào),但表達(dá)量都比RSV感染組同時間點(diǎn)明顯下降,且下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在加入C23siRNA后,TLR4和C23 mRNA表達(dá)比RSV感染組同一時間點(diǎn)的表達(dá)量降低。(3) Western b lot法測定結(jié)果顯示,正常對照組中TLR4和C23蛋白表達(dá)量較低,在RSV感染組,TLR4和C23蛋白在感染的1、2和4 h表達(dá)水平開始增強(qiáng),4 h達(dá)到最高表達(dá)量,4 h后開始下降,至感染的48 h時,TLR4和C23蛋白表達(dá)水平較正常對照組一直處于增強(qiáng)狀態(tài)；在TLR4或C23 siRNA組,TLR4和C23蛋白表達(dá)雖有上調(diào),但表達(dá)量都比RSV感染組同時間點(diǎn)明顯下降,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RSV感染組中TLR3/TLR7/NF-KB蛋白表達(dá)升高具有時間依賴性；在C23siRNA組,TLR3/TLR7/NF-KB蛋白的表達(dá)量雖有上調(diào),仍比RSV感染組同時間點(diǎn)降低；在給予TLR4 siRNA處理后,TLR3/TLR7/NF-KB與RSV感染組和C23siRNA組同時間點(diǎn)相比降低的更明顯,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；通過阻斷TLR4或C23受體的表達(dá),可以降低TLR3/TLR7/NF-KB在RSV感染N2a細(xì)胞過程中的活化過程。(4)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,RSV感染N2a細(xì)胞48 h,可見細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡與晚期凋亡,晚期凋亡比例大于早期凋亡；TLR4 siRNA組和C23 siRNA組凋亡比例比RSV感染組凋亡比例下降,可見TLR4或C23阻斷后,可以降低RSV感染N2a細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生。(5)PFU結(jié)果顯示,RSV感染N2a細(xì)胞培養(yǎng)上清中RSV滴度隨感染時間的延長而逐漸增加；分別給予TLR4或C23 siRNA干擾后,RSV復(fù)制滴度水平較RSV感染組明顯減少,TLR4 siRNA組較RSV感染組和C23 siRNA組病毒的滴度下降的更為明顯,TLR4受體在識別RSV過程中可能具有更重要的作用。(6)ELSIA法結(jié)果顯示,RSV感染組IL-6、IL-8和TNF-α炎癥因子隨著感染時間的延長逐漸升高；轉(zhuǎn)染TLR4 siRNA后,IL-6、IL-8和TNF-a的含量與RSV感染組同時間點(diǎn)相比降低更明顯；在C23 siR NA組,IL-6、IL-8和TNF-α的含量與RSV感染組相比下降；沉默TLR4或C23受體表達(dá)可以減輕RSV感染過程中所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。結(jié)論N2a細(xì)胞膜表面的TLR4和核仁素受體可以結(jié)合RSV F蛋白,從而識別病毒進(jìn)入細(xì)胞,活化TLR4、TLR3、TLR7、NF-κB的表達(dá),使下游細(xì)胞炎性因子IL-6、IL-8和TNF-a分泌升高,介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)的產(chǎn)生,導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷與凋亡

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R56;R747.9
【目錄】：

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【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：211410