發(fā)布時(shí)間：2018-07-03 17:48

  本文選題：支氣管哮喘 + 白介素-13�。� 參考：《瀘州醫(yī)學(xué)院》2012年碩士論文

【摘要】：目的：支氣管哮喘是由多種細(xì)胞（如嗜酸性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞，T細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞等）和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，反復(fù)發(fā)作性喘息，可逆性氣道狹窄和氣道重塑是其主要特征。依賴(lài)于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6（STAT6）持續(xù)活化與過(guò)度表達(dá)，使T細(xì)胞向Th2優(yōu)勢(shì)分化和Th2分泌IL-4，IL-5，，IL-13等炎性介質(zhì)，是哮喘主要的病理生理基礎(chǔ)。本研究通過(guò)STAT6圈套寡核苷酸（ODN）和哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞的共同培養(yǎng)來(lái)觀察STAT6圈套寡核苷酸（ODN）對(duì)哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-13表達(dá)的影響。方法：（1）實(shí)驗(yàn)分組：將48只BALB/c雌性小鼠分成兩組：Ⅰ組，正常小鼠8只；Ⅱ組，哮喘小鼠40只；其中Ⅱ組哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞分成5組：空白對(duì)照組（A組）、哮喘OVA組（B組）、哮喘脂質(zhì)體組（C組）哮喘圈套ODN組（D組）、哮喘無(wú)序ODN組（E組）。哮喘組用卵白蛋白(OVA)和氫氧化鋁建立哮喘模型，分別于第0、7、14天腹腔注射OVA致敏，第21天至28天霧化吸入5%OVA激發(fā)，每天一次，每次30分鐘。正常小鼠組以生理鹽水代替OVA。（2）末次激發(fā)24小時(shí)后，處死小鼠收集肺泡灌洗液分別行白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的分類(lèi)計(jì)數(shù)；HE染色肺組織切片觀察氣道炎癥變化。取出哮喘小鼠的脾臟，分離脾淋巴細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)并由陽(yáng)離子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染劑攜帶合成的全鏈硫代修飾的STAT6寡核苷酸（ODN）轉(zhuǎn)染細(xì)胞，再用OVA激發(fā)淋巴細(xì)胞使其激發(fā)活化。24小時(shí)后離心收集培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞上清液并采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測(cè)定其中的IL-13含量，離心后沉淀的細(xì)胞抽提總RNA逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)為cDNA，建立實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析IL-13mRNA的相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示,用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：（1）Ⅱ組與Ⅰ組比較，支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞均增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；（2）病理切片HE染色顯示：Ⅰ組支氣管上皮完整，杯狀細(xì)胞少見(jiàn)，基底層及平滑肌層較薄，血管及氣道周?chē)?jiàn)極少量炎癥細(xì)胞，支氣管管腔內(nèi)無(wú)大量分泌物；Ⅱ組氣管和血管周?chē)胺闻莞魞?nèi)見(jiàn)大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道上皮細(xì)胞增生肥大，上皮不完整，上皮下基底層明顯增厚，氣管內(nèi)分泌物潴留，支氣管平滑肌增生（3）脾淋巴細(xì)胞IL-13mRNA的表達(dá)水平：空白組（A組）、哮喘OVA組(B組)、哮喘脂質(zhì)體組（C組）哮喘圈套ODN組（D組）、哮喘無(wú)序ODN組（E組）的淋巴細(xì)胞IL-13mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為：1.97253±0.17883、4.54200±0.51474、4.22287±0.29981、2.09736±0.20819、4.37192±0.31691。哮喘ODN組(D組)和空白組（A組）低于哮喘OVA組(B組)、哮喘脂質(zhì)體組（C組），哮喘無(wú)序ODN組（E組）(P0.01)；哮喘ODN組(D組)和空白組（A組）間的差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；哮喘脂質(zhì)體組（C組）哮喘無(wú)序ODN組（E組）和哮喘OVA組(B組)之間的差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；4.脾淋巴細(xì)胞上清液中IL-13的含量：空白組（A組）、哮喘OVA組(B組)、哮喘脂質(zhì)體組（C組）、哮喘ODN組(D組)、哮喘無(wú)序ODN組（E組）IL-13含量分別為：1.51093±0.10415、2.97970±0.12980、2.88808±0.08958、1.57130±0.10443、2.93010±0.10128。哮喘ODN組(D組)和空白組（A組）低于哮喘OVA組(B組)、哮喘脂質(zhì)體組（C組）和哮喘無(wú)序ODN組（E組）(P0.01)；哮喘ODN組(D組)和空白組（A組）間的差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；哮喘脂質(zhì)體組（C組）哮喘無(wú)序ODN組（E組）和哮喘OVA組(B組)之間的差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：用熒光顯微鏡觀察脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染FITC標(biāo)記的STAT6圈套ODN能順利進(jìn)入哮喘小鼠的脾淋巴細(xì)胞；STAT6圈套ODN能特異性抑制哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞中IL-13ｍRNA的轉(zhuǎn)錄和IL-13的分泌；脂質(zhì)體和無(wú)序ODN對(duì)哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞表達(dá)IL-13的影響沒(méi)有差異性，說(shuō)明STAT6圈套ODN對(duì)哮喘小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-13的表達(dá)影響具有特異性而非脂質(zhì)體和核酸的作用。
[Abstract]:Objective: bronchial asthma is an airway chronic inflammatory disease involving multiple cells, such as eosinophils, mast cells, T cells, neutrophils and airway epithelial cells, and cell components. Repeated paroxysmal wheezing, reversible airway stenosis and airway remodeling are its main characteristics. It depends on signal transduction and transcription activator 6. STAT6) continuous activation and overexpression, the differentiation of T cells to Th2 and Th2 secretion of IL-4, IL-5, IL-13 and other inflammatory mediators, which are the main pathophysiological basis of asthma. This study observed STAT6 trap oligonucleotides (ODN) on the splenic lymphocyte IL in asthmatic mice by co culture of STAT6 trap oligonucleotides (ODN) and asthmatic mice splenic lymphocytes The effect of -13 expression. Methods: (1) experimental group: 48 female mice were divided into two groups: group I, 8 normal mice, group II and 40 asthmatic mice, of which group II asthma mice spleen lymphocytes were divided into 5 groups: blank control group (group A), asthma OVA group (B group), asthma liposome group (C group) ODN group (D group), asthma disorder ODN, ODN disorder ODN Group (group E). Asthma group was established with OVA and aluminum hydroxide to establish asthma model, OVA sensitized by intraperitoneal injection on day 0,7,14, and 5%OVA stimulated by inhalation from twenty-first days to 28 days, once a day, 30 minutes each time. Normal mice were treated with saline instead of OVA. (2) for 24 hours, and the mice were sacrificed to collect bronchoalveolar lavage fluid. The taxonomy of cells, lymphocytes and eosinophils were counted; HE stained lung tissue sections were used to observe the changes in airway inflammation. The spleen of the asthmatic mice was taken out and splenic lymphocytes were separated. The cells were cultured in vitro and carried by the cationic liposome 2000 transfection agent to transfect the whole chain thiosulfate modified STAT6 oligodeoxynucleotides (ODN). Then OVA was used to stimulate the cells. The lymphocyte supernatant was collected and cultured after activation of.24 hours, and the content of IL-13 was measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). After centrifugation, the precipitated cells extracted total RNA reverse transcriptase to cDNA, and established the real-time fluorescent PCR reaction conditions for PCR amplification and analyzed the relative content of IL-13mRNA. Experimental data collection was collected. By means of mean mean standard deviation ((?) + s), statistical analysis was performed with SPSS17.0 statistical software. Results: (1) compared with group I, the white blood cells, lymphocytes and eosinophils in the bronchoalveolar lavage fluid were all higher, and were statistically significant (P0.01). (2) pathological section HE staining showed that the bronchial epithelium in group I was intact and the goblet cells were rare. The basal layer and smooth muscle layer were thin, and there were very small amount of inflammatory cells around the vessel and the airway. There was no large secretion in the bronchial tube. In group II, a large number of eosinophilic granulocytes were found in the trachea and the perivascular and alveolar septum, the epithelial cells were hyperplastic, the epithelium was not complete, the subepithelial basement layer was thickened, the secretory retention of the trachea and the branch in the trachea. The expression level of IL-13mRNA in the splenic lymphocyte of tracheal smooth muscle hyperplasia (3): blank group (group A), asthma OVA group (group B), asthma liposome group (group C) asthma trap ODN group (group D), and the relative expression of IL-13mRNA in lymphocyte of asthma disorder ODN group (E group): 1.97253 + 0.17883,4.54200 + 0.51474,4.22287 + + + + 7192 + 0.31691. asthma group ODN (group D) and blank group (group A) were lower than group OVA of asthma (group B), asthma liposome group (C group), asthma disorder ODN group (E group) (P0.01), and there was no statistical difference between asthmatic ODN group (D group) and blank group; the difference between asthma disorder group and asthma group There was no statistical significance (P0.05); 4. the content of IL-13 in the supernatant of spleen lymphocyte: blank group (group A), asthma OVA group (B group), asthma liposome group (C group), asthma ODN group (D group), and asthmatic ODN group (E group) IL-13 content respectively: 1.51093 + + + + + + + + + + asthmatic asthma Group (group D) and blank group (group A) were lower than group OVA of asthma (group B), asthma liposome group (C group) and asthma disorder ODN group (E group) (P0.01), and there was no significant difference between asthmatic group ODN group (D group) and blank group (A group), and there was no significant difference between asthma disorder group and asthma group (Group). 0.05) conclusion: it is concluded that the STAT6 trap ODN labeled by liposome 2000 transfected with FITC can successfully enter the spleen lymphocytes of the asthmatic mice, and STAT6 trap ODN can specifically inhibit the transcription of IL-13mRNA and the secretion of IL-13 in the spleen lymphocytes of the asthmatic mice, and the expression of IL-13 in the spleen lymphocytes of the asthmatic mice by liposomes and unordered ODN The effect of STAT6 decoy ODN on the expression of IL-13 in spleen lymphocytes of asthmatic mice is specific, rather than that of liposomes and nucleic acids.
【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R562.25

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本文編號(hào)：2094503