2致肺泡巨噬細(xì)胞自噬對(duì)其分泌相關(guān)因子的影響
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《華北理工大學(xué)》 2015年
SiO_2致肺泡巨噬細(xì)胞自噬對(duì)其分泌相關(guān)因子的影響
朱會(huì)興
【摘要】:目的采用體外培養(yǎng)細(xì)胞的方法,使用Si O2體外刺激染塵法制備細(xì)胞損傷模型。探討:1自噬抑制劑3-MA(3-methyl adenine,3-MA)對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞(Alveolar macrophages,AM)自噬的調(diào)控及其釋放炎性因子的影響;2 AM上清液對(duì)肺成纖維細(xì)胞(Fibroblast,FB)所產(chǎn)生的影響。方法1模型制備及分組:應(yīng)用肺灌洗法收集AM,體外暴露AM染塵的方法制作模型,在染塵成功12 h后,給予自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤干預(yù)(10mmol/L)。取10只胎鼠用于FB分離及培養(yǎng),并使用各組的AM上清液分別對(duì)FB進(jìn)行干預(yù)刺激。并于干預(yù)后6 h、18 h、24 h、36 h用胰酶消化,收集體外培養(yǎng)的細(xì)胞。分組:將30只雄性SPF級(jí)SD大鼠(體重190~220g)肺灌洗出的AM隨機(jī)方法分成三組:AM組(對(duì)照組)、AM+Si O2組(Si O2組)、AM+Si O2+3-MA組(3-MA組);用各組的AM上清液刺激分別為,AM上清+FB組(對(duì)照干預(yù)組),AM上清+Si O2+FB組(Si O2+FB組),AM上清+Si O2+3-MA+FB組(3-MA干預(yù)組)。2檢測(cè)指標(biāo)及方法:○1一般形態(tài)學(xué)觀察:使用HE染色的方法檢測(cè)AM形態(tài)學(xué)改變;○2免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)LC-3,Beclin-1,TNF-α,TGF-β的表達(dá)及分布;○3免疫印跡法檢測(cè)LC-3,Beclin-1,TNF-α,TGF-β,I、III型膠原的蛋白表達(dá)量。3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:使用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞陽(yáng)性度,并用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析,用積分光密度值(IOD值)表示。蛋白定量使用Image J圖像分析處理軟件對(duì)蛋白所反應(yīng)的條帶進(jìn)行半定量分析,得到光密度值(OD值),以目的蛋白的OD值比內(nèi)參(β-actin)OD值的比值,做為基礎(chǔ)對(duì)照進(jìn)行對(duì)比。在本實(shí)驗(yàn)中獲取的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果使用Excel建立,用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(`x±s)體現(xiàn),使用SPSS 16.0系統(tǒng)將所得數(shù)據(jù)隨機(jī)的單因素方差分析,兩組間的比較采用qq檢驗(yàn)的方式,用P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1 AM的形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果:HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組中AM呈現(xiàn)出圓形或橢圓形,細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰,形態(tài)均一,并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)矽塵顆粒。同對(duì)照組相比較,模型組AM的體積出現(xiàn)明顯變大,多為不規(guī)則形狀,細(xì)胞核為嗜堿性染色,細(xì)胞核大多居于細(xì)胞的中間部位或靠近邊緣,細(xì)胞胞質(zhì)相對(duì)較豐富,有些AM的細(xì)胞胞漿內(nèi)可發(fā)現(xiàn)矽塵顆粒。2免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果:LC-3,Beclin-1,TNF-α,TGF-β均為胞漿表達(dá),對(duì)照組LC-3,Beclin-1,TNF-α,TGF-β僅有微弱表達(dá),呈現(xiàn)淡棕黃色。與對(duì)照組相比,矽肺模型組在各時(shí)間點(diǎn)的陽(yáng)性表達(dá)均增強(qiáng),免疫反應(yīng)性較強(qiáng),并且其表達(dá)變化趨勢(shì),伴隨時(shí)間的增加,其表達(dá)強(qiáng)度也相應(yīng)增加,到達(dá)第18 h時(shí)達(dá)到高峰(P0.05)。與矽肺模型組相比,3-MA組在相對(duì)應(yīng)的各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)都發(fā)生減弱,但整體表達(dá)趨勢(shì)未發(fā)生改變。3免疫細(xì)胞印跡檢測(cè)結(jié)果:對(duì)照組中LC-3,Beclin-1,TNF-α,TGF-β的蛋白表達(dá)僅顯示出少量的基本結(jié)果,并且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)都沒(méi)有顯著變化。同對(duì)照組進(jìn)行比較得出,矽肺模型組LC-3,Beclin-1,TNF-α,TGF-β各蛋白的表達(dá)都出現(xiàn)了顯著的增長(zhǎng)趨勢(shì)(P0.05)。并且表達(dá)情況為動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì),從6 h時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)上升,持續(xù)增長(zhǎng)到第18 h到達(dá)增長(zhǎng)高峰,24 h和36 h時(shí)表達(dá)出現(xiàn)下降,相對(duì)于對(duì)照組同時(shí)間的表達(dá)水平仍有明顯的增高。對(duì)比模型組,3-MA組中的LC-3,Beclin-1,TNF-α,TGF-β各蛋白在每個(gè)時(shí)問(wèn)點(diǎn)的表達(dá)都出現(xiàn)了明顯的下降,變化趨勢(shì)沒(méi)發(fā)生改變,表達(dá)高峰仍然出現(xiàn)在第18 h(P0.05)。在對(duì)照干預(yù)組中I、III型膠原蛋白僅有少量的基礎(chǔ)表達(dá),并且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)并沒(méi)有發(fā)生明顯變化趨勢(shì)改變。相對(duì)于對(duì)照干預(yù)組相,模型干預(yù)組中I、III型膠原的蛋白表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)都有明顯的增高(P0.05),并且蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì),從6 h時(shí)即開(kāi)始增高,隨時(shí)間變化蛋白的表達(dá)也持續(xù)升高,到36 h時(shí)蛋白的表達(dá)水平達(dá)到增長(zhǎng)的高峰(P0.05)。相對(duì)于模型干預(yù)組,3-MA上清組I、III型膠原蛋白的表達(dá)在相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)都出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)(P0.05),蛋白的整體表達(dá)變化趨勢(shì)沒(méi)有發(fā)生改變。結(jié)論在大鼠矽肺的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中抑制了自噬的發(fā)生后,可以下調(diào)AM中相關(guān)因子的表達(dá)及釋放,進(jìn)而促進(jìn)炎癥損傷的修復(fù)。AM上清干預(yù)組減少FB中纖維化因子的釋放,進(jìn)而緩解矽肺病的加重。
【關(guān)鍵詞】:
【學(xué)位授予單位】:華北理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2015
【分類(lèi)號(hào)】:R135.2
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【參考文獻(xiàn)】
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【共引文獻(xiàn)】
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【二級(jí)參考文獻(xiàn)】
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7 陳皎皎;自噬/溶酶體途徑在小鼠皮層神經(jīng)元糖氧剝奪離體缺血模型中的作用[D];蘇州大學(xué);2008年
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9 乜全民;大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后自噬的初步研究[D];蘇州大學(xué);2009年
10 朱娜;自噬通路在泛素連接酶Hrd1介導(dǎo)的α1-抗胰蛋白酶Z突變體降解中的作用[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2014年
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本文編號(hào):192803
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