本文關(guān)鍵詞：卵母細(xì)胞玻璃化冷凍對(duì)卵子特異性基因表達(dá)的影響

  更多相關(guān)文章： 玻璃化冷凍 卵母細(xì)胞 發(fā)育潛能 卵子特異性基因

【摘要】：近年來輔助生育技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)及其衍生技術(shù)迅速發(fā)展,從最初的體外受精-胚胎培養(yǎng)(IVF-ET),到逐漸發(fā)展成熟的單精子卵泡漿內(nèi)注射(ICSI)、冷凍胚胎移植(FET),再到近年來不斷推廣應(yīng)用的胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查(PGD/PGS)等,生殖相關(guān)技術(shù)難題逐漸得到攻克,并使越來越多的不孕不育夫婦從中受益。配子和胚胎冷凍技術(shù)是生育力保存和輔助生殖領(lǐng)域的重要組成部分,其中胚胎的程序化冷凍和玻璃化冷凍目前已常規(guī)應(yīng)用于世界各地的輔助生育中心,而卵母細(xì)胞因其體積大、含水量多、細(xì)胞核無核膜包繞保護(hù)、膜的滲透性低等特點(diǎn),被相關(guān)領(lǐng)域研究者認(rèn)為是最難成功凍融的細(xì)胞類型。既往多項(xiàng)研究表明,在卵母細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇中,玻璃化冷凍技術(shù)較程序化慢速冷凍技術(shù)更為高效,由此可見,卵母細(xì)胞玻璃化冷凍技術(shù)的成功應(yīng)用不僅對(duì)人類輔助生育技術(shù)的完善和發(fā)展有重要意義,對(duì)核移植工程和珍稀物種生殖資源的保存亦有重要推進(jìn)作用。玻璃化冷凍技術(shù)是應(yīng)用高濃度冷凍保護(hù)劑置換胞液中的水分,使細(xì)胞在超速冷凍降溫過程中避免胞內(nèi)冰晶形成進(jìn)而導(dǎo)致冷凍損傷的技術(shù)。然而,卵母細(xì)胞超快速凍融過程和玻璃化冷凍保護(hù)劑本身均會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)及附屬結(jié)構(gòu)(如透明帶、紡錘體、細(xì)胞骨架等)帶來一定損傷,進(jìn)而影響復(fù)蘇率、體外受精后的受精率及早期胚胎發(fā)育潛能。國內(nèi)外在卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)領(lǐng)域的研究多集中于比較兩種冷凍方法(程序化慢速冷凍及玻璃化冷凍)或不同冷凍載體的冷凍效率、冷凍復(fù)蘇體系的建立和改進(jìn)等方面,針對(duì)冷凍技術(shù)對(duì)卵母細(xì)胞產(chǎn)生影響的具體機(jī)制如基因表達(dá)、表觀遺傳修飾等方面則研究較少。卵母細(xì)胞特異性發(fā)育相關(guān)基因是一類卵母細(xì)胞內(nèi)特有的、參與卵泡生成與成熟、受精與早期胚胎發(fā)育過程的關(guān)鍵基因。而目前國內(nèi)外將這類基因表達(dá)結(jié)合玻璃化冷凍技術(shù)的研究很少。本研究將成熟期(mii)卵母細(xì)胞分別行冷凍-復(fù)蘇液處理和玻璃化冷凍-復(fù)蘇,與新鮮mii卵母細(xì)胞比較體外受精后早期胚胎發(fā)育情況及卵母細(xì)胞特異性發(fā)育相關(guān)基因h1foo、bmp15、gdf9、sohlh2、nobox表達(dá)水平,探索玻璃化冷凍-復(fù)蘇液毒性及玻璃化冷凍-復(fù)蘇技術(shù)對(duì)小鼠成熟期卵母細(xì)胞體外受精后早期胚胎發(fā)育潛能及卵母細(xì)胞特異性發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響,并通過比較h1foo-α基因在新鮮及玻璃化冷凍-復(fù)蘇后mii期卵母細(xì)胞中的甲基化水平差異,初步探索玻璃化冷凍影響卵子特異性組蛋白h1foo表達(dá)的機(jī)制。本研究首先將c57bl/6小鼠成熟期卵母細(xì)胞隨機(jī)分為新鮮對(duì)照組、冷凍復(fù)蘇液處理組及玻璃化冷凍復(fù)蘇組,各組分別取40枚進(jìn)行卵子特異性基因h1foo、bmp15、gdf9、sohlh2、nobox的mrna表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)h1foo亞型h1foo-α在冷凍復(fù)蘇組的表達(dá)顯著低于冷凍復(fù)蘇液處理組及新鮮對(duì)照組(p0.05),而另一亞型h1foo-β及其他四個(gè)卵子特異性基因bmp15、gdf9、sohlh2和nobox的mrna表達(dá)在組間無顯著差異(p0.05)。應(yīng)用westernblot實(shí)驗(yàn)研究h1foo的蛋白表達(dá)水平在新鮮組及玻璃化冷凍復(fù)蘇組是否有差異,結(jié)果顯示,與real-timepcr結(jié)果一致,h1foo-α的蛋白表達(dá)水平在玻璃化冷凍復(fù)蘇組顯著低于新鮮組。進(jìn)一步檢測h1foo基因啟動(dòng)序列的甲基化程度,發(fā)現(xiàn)在該測序區(qū)段內(nèi),玻璃化冷凍組100枚mii期卵母細(xì)胞的甲基化程度(87.5%)較新鮮組100枚mii期卵母細(xì)胞的甲基化程度(75%)高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。在第二部分實(shí)驗(yàn)中,197枚成熟期卵母細(xì)胞隨機(jī)分為三組,新鮮對(duì)照組64枚,冷凍復(fù)蘇液處理組65枚,玻璃化冷凍復(fù)蘇組68枚,行體外受精比較三組卵母細(xì)胞所獲早期胚胎的2-細(xì)胞率及囊胚率。應(yīng)用冷凍-復(fù)蘇液處理后的卵母細(xì)胞體外受精后,其2-細(xì)胞率(卵裂率)與囊胚率分別為77.42%及56.25%,與新鮮對(duì)照組2-細(xì)胞率(81.25%)及囊胚率(57.7%)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。而冷凍復(fù)蘇后的卵母細(xì)胞體外受精后,其2-細(xì)胞率(63.93%)較新鮮對(duì)照組及冷凍復(fù)蘇液處理組均顯著下降(p0.05),而囊胚率(53.84%)較新鮮組及冷凍復(fù)蘇液處理組有下降趨勢(shì),而差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。綜上,本研究發(fā)現(xiàn),玻璃化冷凍-復(fù)蘇液對(duì)卵母細(xì)胞體外受精后卵子特異性基因表達(dá)及早期胚胎發(fā)育無顯著影響(p0.05),而冷凍復(fù)蘇這一過程會(huì)降低h1foo-αmrna和蛋白表達(dá)水平(p0.05)及體外受精后2-細(xì)胞率(p0.05),在對(duì)改變h1foo表達(dá)機(jī)制的初步研究中發(fā)現(xiàn),H1foo在玻璃化冷凍-復(fù)蘇后的甲基化程度升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。
【關(guān)鍵詞】：玻璃化冷凍 卵母細(xì)胞 發(fā)育潛能 卵子特異性基因
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R714.8
【目錄】：

• 摘要5-9
• ABSTRACT9-15
• 符號(hào)說明15-17
• 前言17-21
• 材料與方法21-34
• 結(jié)果34-40
• 討論40-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-57
• 附錄：綜述 卵子特異性連接組蛋白H1foo在卵子與早期胚胎發(fā)育中表達(dá)及功能的研究進(jìn)展57-67
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 致謝67-68
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表文章目錄68

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