本文關(guān)鍵詞：卵母細胞玻璃化冷凍對卵子特異性基因表達的影響

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【摘要】：近年來輔助生育技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)及其衍生技術(shù)迅速發(fā)展,從最初的體外受精-胚胎培養(yǎng)(IVF-ET),到逐漸發(fā)展成熟的單精子卵泡漿內(nèi)注射(ICSI)、冷凍胚胎移植(FET),再到近年來不斷推廣應(yīng)用的胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查(PGD/PGS)等,生殖相關(guān)技術(shù)難題逐漸得到攻克,并使越來越多的不孕不育夫婦從中受益。配子和胚胎冷凍技術(shù)是生育力保存和輔助生殖領(lǐng)域的重要組成部分,其中胚胎的程序化冷凍和玻璃化冷凍目前已常規(guī)應(yīng)用于世界各地的輔助生育中心,而卵母細胞因其體積大、含水量多、細胞核無核膜包繞保護、膜的滲透性低等特點,被相關(guān)領(lǐng)域研究者認為是最難成功凍融的細胞類型。既往多項研究表明,在卵母細胞的凍存和復(fù)蘇中,玻璃化冷凍技術(shù)較程序化慢速冷凍技術(shù)更為高效,由此可見,卵母細胞玻璃化冷凍技術(shù)的成功應(yīng)用不僅對人類輔助生育技術(shù)的完善和發(fā)展有重要意義,對核移植工程和珍稀物種生殖資源的保存亦有重要推進作用。玻璃化冷凍技術(shù)是應(yīng)用高濃度冷凍保護劑置換胞液中的水分,使細胞在超速冷凍降溫過程中避免胞內(nèi)冰晶形成進而導(dǎo)致冷凍損傷的技術(shù)。然而,卵母細胞超快速凍融過程和玻璃化冷凍保護劑本身均會對卵母細胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)及附屬結(jié)構(gòu)(如透明帶、紡錘體、細胞骨架等)帶來一定損傷,進而影響復(fù)蘇率、體外受精后的受精率及早期胚胎發(fā)育潛能。國內(nèi)外在卵母細胞冷凍技術(shù)領(lǐng)域的研究多集中于比較兩種冷凍方法(程序化慢速冷凍及玻璃化冷凍)或不同冷凍載體的冷凍效率、冷凍復(fù)蘇體系的建立和改進等方面,針對冷凍技術(shù)對卵母細胞產(chǎn)生影響的具體機制如基因表達、表觀遺傳修飾等方面則研究較少。卵母細胞特異性發(fā)育相關(guān)基因是一類卵母細胞內(nèi)特有的、參與卵泡生成與成熟、受精與早期胚胎發(fā)育過程的關(guān)鍵基因。而目前國內(nèi)外將這類基因表達結(jié)合玻璃化冷凍技術(shù)的研究很少。本研究將成熟期(mii)卵母細胞分別行冷凍-復(fù)蘇液處理和玻璃化冷凍-復(fù)蘇,與新鮮mii卵母細胞比較體外受精后早期胚胎發(fā)育情況及卵母細胞特異性發(fā)育相關(guān)基因h1foo、bmp15、gdf9、sohlh2、nobox表達水平,探索玻璃化冷凍-復(fù)蘇液毒性及玻璃化冷凍-復(fù)蘇技術(shù)對小鼠成熟期卵母細胞體外受精后早期胚胎發(fā)育潛能及卵母細胞特異性發(fā)育相關(guān)基因表達的影響,并通過比較h1foo-α基因在新鮮及玻璃化冷凍-復(fù)蘇后mii期卵母細胞中的甲基化水平差異,初步探索玻璃化冷凍影響卵子特異性組蛋白h1foo表達的機制。本研究首先將c57bl/6小鼠成熟期卵母細胞隨機分為新鮮對照組、冷凍復(fù)蘇液處理組及玻璃化冷凍復(fù)蘇組,各組分別取40枚進行卵子特異性基因h1foo、bmp15、gdf9、sohlh2、nobox的mrna表達水平。發(fā)現(xiàn)h1foo亞型h1foo-α在冷凍復(fù)蘇組的表達顯著低于冷凍復(fù)蘇液處理組及新鮮對照組(p0.05),而另一亞型h1foo-β及其他四個卵子特異性基因bmp15、gdf9、sohlh2和nobox的mrna表達在組間無顯著差異(p0.05)。應(yīng)用westernblot實驗研究h1foo的蛋白表達水平在新鮮組及玻璃化冷凍復(fù)蘇組是否有差異,結(jié)果顯示,與real-timepcr結(jié)果一致,h1foo-α的蛋白表達水平在玻璃化冷凍復(fù)蘇組顯著低于新鮮組。進一步檢測h1foo基因啟動序列的甲基化程度,發(fā)現(xiàn)在該測序區(qū)段內(nèi),玻璃化冷凍組100枚mii期卵母細胞的甲基化程度(87.5%)較新鮮組100枚mii期卵母細胞的甲基化程度(75%)高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。在第二部分實驗中,197枚成熟期卵母細胞隨機分為三組,新鮮對照組64枚,冷凍復(fù)蘇液處理組65枚,玻璃化冷凍復(fù)蘇組68枚,行體外受精比較三組卵母細胞所獲早期胚胎的2-細胞率及囊胚率。應(yīng)用冷凍-復(fù)蘇液處理后的卵母細胞體外受精后,其2-細胞率(卵裂率)與囊胚率分別為77.42%及56.25%,與新鮮對照組2-細胞率(81.25%)及囊胚率(57.7%)相比無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。而冷凍復(fù)蘇后的卵母細胞體外受精后,其2-細胞率(63.93%)較新鮮對照組及冷凍復(fù)蘇液處理組均顯著下降(p0.05),而囊胚率(53.84%)較新鮮組及冷凍復(fù)蘇液處理組有下降趨勢,而差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。綜上,本研究發(fā)現(xiàn),玻璃化冷凍-復(fù)蘇液對卵母細胞體外受精后卵子特異性基因表達及早期胚胎發(fā)育無顯著影響(p0.05),而冷凍復(fù)蘇這一過程會降低h1foo-αmrna和蛋白表達水平(p0.05)及體外受精后2-細胞率(p0.05),在對改變h1foo表達機制的初步研究中發(fā)現(xiàn),H1foo在玻璃化冷凍-復(fù)蘇后的甲基化程度升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。
【關(guān)鍵詞】：玻璃化冷凍 卵母細胞 發(fā)育潛能 卵子特異性基因
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R714.8
【目錄】：

• 摘要5-9
• ABSTRACT9-15
• 符號說明15-17
• 前言17-21
• 材料與方法21-34
• 結(jié)果34-40
• 討論40-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻50-57
• 附錄：綜述 卵子特異性連接組蛋白H1foo在卵子與早期胚胎發(fā)育中表達及功能的研究進展57-67
• 參考文獻63-67
• 致謝67-68
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表文章目錄68

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